PRUEBAS DE COOMBS

 fue desarrollado en el año 1945 por Coombs, Mourant y Race, con

el fin de detectar los anticuerpos eritrocitarios incapaces de
LA producir aglutinación eritrocitaria por sí solos.

ANTIGLOBULI  Coombs y su equipo postulaban que la inyección de suero humano

a un animal de laboratorio inducía el desarrollo de anticuerpos
NA HUMANA frente a las globulinas humanas. Estos anticuerpos podían ser
utilizados más adelante para el reconocimiento específico de estas
globulinas.
SUERO DE
COOMBS.
ORIGEN
  Son capaces de sensibilizar los hematíes suspendidos en salina,
cuando reconocen un antígeno específico en su membrana, y
IgM producir posteriormente aglutinación directa de los hematíes
adyacentes.
  son capaces de unirse a los hematíes, pero no de producir
IgG aglutinación por sí solos.
DISTINTOS
SUEROS DE
COOMBS
  Los dos sitios Fab en la molécula de antiglobulina se unen a la
porción Fc del anticuerpo sensibilizante (o al componente del
complemento), disminuyendo así el espacio entre los glóbulos
rojos para producir una aglutinación visible.

COMO ACTUA
EL SAGH
 La intensidad de la aglutinación observada suele ser proporcional
a la cantidad de globulinas unidas a los hematíes.
 En los reactivos policlonales es frecuente que haya anticuerpos
que reconocen las cadenas ligeras de los anticuerpos humanos, lo
que puede ser una ventaja en caso de los reactivos poliespecíficos,
ya que se favorece la aglutinación eritrocitaria. Sin embargo, en el
reactivo monoespecífico anti-IgG puede ser un problema, pues
como las cadenas ligeras son compartidas por el resto de
inmunoglobulinas, puede dar lugar a falsos positivos
PCD.  Estudiar la unión antígeno-anticuerpo producida in vivo, permite
detectar la presencia de inmunoglobulinas y/o fracciones del
OBJETIVO complemento adheridas in vivo a los hematíes
  Se obtiene sangre del paciente a estudio y, tras realizar un lavado
para retirar posibles anticuerpos presentes en el plasma, se
PCD. enfrentan los hematíes con el suero de antiglobulina.
FUNDAMENT  Si los hematíes presentan inmunoglobulinas y/o fracciones del
complemento en su membrana, se producirá una aglutinación
O visible y la prueba se considerará positiva.
 En caso contrario, la prueba será negativa
  Tras el hallazgo de un autocontrol reactivo en el estudio de
PCD. anticuerpos irregulares: puede deberse a la presencia de
anticuerpos en la membrana eritrocitaria (autoanticuerpos o
INDICACIONES aloanticuerpos en el contexto de una reacción serológica
postransfusión)
  Anemia hemolítica autoinmune: como ayuda en el diagnóstico
PCD. junto a los parámetros analíticos de hemólisis y los datos clínicos
INDICACIONES del paciente. En estos casos es importante conocer la clase de
proteína implicada, dado que tiene valor en el diagnóstico
PCD.  En el estudio de reacción hemolítica postransfusional: si la PCD es
negativa en la muestra pretransfusional y positiva en la muestra
INDICACIONES postransfusional, se debe descartar un proceso hemolítico
aloinmune frente a los hematíes recién transfundidos
  Enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido: como ayuda
en el diagnóstico junto al estudio de la madre y los datos clínicos y
analíticos del niño. En este caso la proteína implicada es de clase
IgG

PCD.
INDICACIONES
PCD.  En el estudio de una prueba cruzada incompatible en un paciente
con un estudio de anticuerpos irregulares negativo: hallazgo de
INDICACIONES una PCD positiva en el donante
PCD.  En el estudio de donantes con SCR positivo o con Rh(D) negativo,
pero positivo en técnica de antiglobulina: hallazgo de una PCD
INDICACIONES positiva en el donante
  Obtener una muestra de hematíes, realizar varios lavados, añadir
SAGH, centrifugar y realizar la lectura.
 Inicialmente, se utiliza el reactivo poliespecífico. Si el test es
positivo, se repite utilizando reactivos monoespecíficos para
valorar el tipo de proteína implicada.
PCD.
METODO EN
TUBO
  Si el resultado es negativo con los reactivos poliespecífico y/o IgG,
se debe descartar que no se haya añadido el reactivo o que éste no
funcione correctamente: para ello se debe realizar el Control de
Coombs.
 El resultado del control debe ser positivo. Si es negativo, invalida
PCD. la prueba

METODO EN
TUBO
PCD.  Si el resultado es positivo con todos los reactivos, es necesario
descartar la presencia de aglutinación eritrocitaria espontánea, de
METODO EN causa no inmune: para ello se debe realizar un control con salina,
albúmina, que debe ser negativo. Si el control es positivo, el test
TUBO no es valorable
  IMPORTANTE
 Es necesario lavar correctamente los hematíes con solución salina.

PCD.  No debe realizarse una centrifugación excesiva, para evitar falsos

positivos.
METODO EN  Lectura inmediata, para evitar que los resultados sean erróneos
TUBO (sobre todo falsos negativos)
 Si el resultado es negativo con los reactivos que detectan C3d,
realizar una incubación de 5 min y una nueva lectura para
favorecer la reactividad del complemento.
  Se trabaja en tarjetas de gel de antiglobulina, únicamente se han
de dispensar los hematíes y realizar la lectura tras una
PCD. centrifugación, siguiendo las instrucciones del fabricante. No es
METODO EN necesario el lavado previo de los hematíes.
 Inicialmente se utilizan las tarjetas con el reactivo poliespecífico.
TARJETA GEL Si el test es positivo, se repite utilizando tarjetas con reactivos
monoespecíficos, para valorar el tipo de proteína implicada.
  Este método ha demostrado tener mayor sensibilidad y menor
especificidad que la técnica de tubo; sin embargo, el significado
clínico de esta prueba no está bien establecido cuando es
únicamente positiva en técnica de gel.

PCD.
METODO EN
TARJETA GEL
PCI.  Estudiar la unión antígeno-anticuerpo tras incubación in vitro.
OBJETIVO
  Se ponen en contacto anticuerpos y antígenos y se realiza una
incubación a 37 °C. El tipo de muestra y de reactivo variará según
sea la prueba a realizar:
PCI.  En una prueba cruzada: hematíes del donante y suero/plasma del
paciente.
FUNDAMENTO  En un estudio de anticuerpos irregulares: hematíes comerciales y
suero/plasma del paciente.
 En un estudio de fenotipo eritrocitario, hematíes del paciente y
antisueros comerciales.
PCI.
INDICACIONES
  Se dispensan anticuerpos y antígenos en el tubo y se realiza una
incubación a 37 °C durante 30 min. Posteriormente se añade la
antiglobulina, se centrifuga y se leen los resultados de forma
inmediata.

PCI.
METODO EN
TUBO
  Si el resultado es negativo, se descarta la falta o el mal
funcionamiento del reactivo: para ello se realiza el “Control de
Coombs”. El resultado del control debe ser positivo. Si es negativo,
invalida la prueba

PCI.
METODO EN
TUBO
  Utilizando una tarjeta de gel de antiglobulina poliespecífica, se
añade 50 microlitros de hematíes y 25 microlitros de
plasma/reactivo comercial. Se incuba a 37 °C, se centrifuga y se lee
el resultado

PCI.
METODO
TARJETA GEL
  Neutralización del reactivo antiglobulina

CAUSAS DE  Fallo del lavado de los hematíes. En la PCI, si se utilizan volúmenes

elevados de plasma, aumentar el número de lavados.
RESULTADOS  Contaminación del reactivo antiglobulina por proteínas exógenas
FALSOS (al utilizar los dedos para cubrir el tubo, y al utilizar cuentagotas
contaminados o procedentes de otro reactivo).
NEGATIVOS  Elevada concentración de paraproteínas IgG en el suero problema,
que puede permanecer a pesar de realizar múltiples lavados
  Interrupción del test
CAUSAS DE  El test se debe leer inmediatamente tras la centrifugación. Si no se
RESULTADOS cumple esta premisa, se pueden producir falsos negativos:

FALSOS – Los anticuerpos IgG adheridos a los hematíes pueden disociarse

y/o neutralizar el reactivo antiglobulina.
NEGATIVOS – La aglutinación eritrocitaria se puede debilitar
  Conservación incorrecta de los reactivos
CAUSAS DE  El reactivo antiglobulina puede perder reactividad si se congela.
RESULTADOS Durante la conservación es posible que se contamine de bacterias.
 El exceso de calor o los procesos de congelación-descongelación
FALSOS son causa de pérdida de reactividad del suero problema.
NEGATIVOS  Los hematíes reactivos pueden perder fuerza antigénica durante
el almacenamiento.
  Procedimientos incorrectos
 Una agitación excesiva al deshacer el botón en la lectura de la
prueba.
 Una sobrecentrifugación puede compactar tanto los hematíes que
la agitación intensa necesaria para deshacer el botón puede
CAUSAS DE producir rotura de los aglutinados.

RESULTADOS  Una centrifugación demasiado suave no es óptima para conseguir

la aglutinación.
FALSOS  Fallos en la adición del suero problema, potenciadores o
NEGATIVOS antiglobulina
 Proporción suero-hematíe inadecuada: una concentración
demasiado elevada de hematíes puede enmascarar una débil
aglutinación.
 Una concentración demasiado baja no permite valorar el grado de
aglutinación.
CAUSAS DE  Complemento
RESULTADOS  Algunos anticuerpos, como ciertos anti-Jka, Jkb, son detectados
FALSOS únicamente cuando se utiliza antiglobulina poliespecífica y existe
complemento activo en la muestra (suero).
NEGATIVOS
CAUSAS DE
 Salina
RESULTADOS  Un ph bajo (< 7) de la solución salina puede reducir la sensibilidad.
FALSOS El pH óptimo para la mayoría de anticuerpos es 7-7,2
NEGATIVOS
CAUSAS DE  Aglutinación celular previa al lavado

RESULTADOS  Cuando existen aglutininas potentes en el suero, los aglutinados

no se dispersan durante el lavado. Es importante observar las
FALSOS células antes de añadir la antiglobulina, o utilizar un control
sustituyendo la antiglobulina por salina. La positividad del control
POSITIVOS invalida el resultado de la prueba.
CAUSAS DE  Existencia de partículas o contaminantes
RESULTADOS  Si existe suciedad, polvo o sílice en el tubo, o mucha fibrina en el
FALSOS suero, es probable que se produzca una agregación de los
hematíes que simulan aglutinación.
POSITIVOS
  Procedimiento incorrecto
CAUSAS DE  Una sobrecentrifugación puede compactar tanto los hematíes,
RESULTADOS que dificulta su dispersión y simulan una reacción positiva.
FALSOS  La centrifugación de los test en los que se utiliza PEG o polímeros
cargados positivamente antes del lavado, puede producir
POSITIVOS agregados que no se dispersan
CAUSAS DE  Células con un test directo de antiglobulina positivo

RESULTADOS  Los hematíes con un test directo de antiglobulina positiva

producirán un resultado positivo en todos los test basados en la
FALSOS prueba indirecta de antiglobulina. Existen procedimientos que
permiten retirar las moléculas de IgG de la membrana de los
POSITIVOS hematíes, evitando esta falsa reacción.
  Complemento
CAUSAS DE  Los componentes del complemento (sobre todo la fracción C4)
RESULTADOS pueden unirse a los hematíes de la sangre coagulada o
anticoagulada con CPDA-1, principalmente tras la conservación a
FALSOS baja temperatura (4 °C). Para realizar la prueba directa de
POSITIVOS antiglobulina es mejor utilizar hematíes de muestras
anticoaguladas con EDTA, ACD o CPD.
MUCHAS
GRACIAS