LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA
PATOLOGICA
BIOLOGIA MOLECULAR
HIBRIDACIÓN IN SITU
[Link]. Héctor E. Herrera Reynoso
Esp: Citogenética y Biología Molecular
Hibridación in situ es una técnica que detecta secuencias de ácidos nucleicos en células, cromosomas
o tejidos preservados.
La detección in situ provee una visualización directa de la localización espacial de secuencias
específicas que es crucial para dilucidar la organización y función génica, por lo que el método de
hibridación in situ se ha convertido en una técnica importante en diversos campos, incluyendo
diagnóstico de rearreglos cromosomales, detección de infecciones virales y análisis de la función
génica durante el desarrollo embrionario.
La hibridación in situ toma como fundamento la complementaridad de los ácidos nucléicos, la cual
puede ser DNA y/o RNA, a través de puentes de hidrógeno formados entre las bases: adenina–timina
(DNA) o uracilo (RNA) y citosina-guanina (DNA y RNA). Este apareamiento da lugar a una doble
cadena en la cual una cadena, tiene la orientación opuesta a la otra con respecto al esqueleto azúcar-
fosfato. La secuencia es leída de 5' a 3'.
La técnica fue desarrollada en 1969 por Gall y Pardue e independientemente por Jonh et al., en el mismo año.
Gall y colaboradores describieron una técnica que formaba híbridos moleculares entre RNA y DNA. La técnica
se llevó a cabo en ovocitos de Xenopus laevis. En ese momento la única forma de marcaje eran los
radioisótopos, por lo que se usó tritio para el experimento y la forma de detección fue por autoradiografía.
Evaluaron variables de la técnica que afectan el rendimiento de la hibridación, haciéndo hincapié en un paso
fundamental que se debe llevar a cabo para realizar la técnica: la desnaturalización.
El clonaje molecular de ácidos nucleicos y el mejoramiento de las técnicas de marcaje radioactivo
han cambiado el panorama dramáticamente. Por ejemplo Harper et al., en 1981 detectó en
cromosomas metafásicos el gen de la insulina. El método de detección fue la autorradiografía. En
1985 Coghlan sintetizó oligonucleótidos marcados radioactivamente para detección. Este mismo
investigador en 1986 detectó citológicamente un bajo número de copias de mRNAs.
La alta sensibilidad que provee la prueba (de 20 a 50 copias de secuencias blanco/célula), así como
el rango tan grande de aplicaciones dió pie a que muchos laboratorios adoptaran la técnica.
Pasos y consideraciones para la hibridación in situ.
La técnica involucra:
a) Generación de ácidos nucleicos marcados para una detección
Subsecuente.
b) Fijación de tejidos (seccionados), preparación de cromosomas.
c) Preparación del tejido para incrementar el acceso del ácido nucleico
Marcado.
d) Hibridación de la sonda marcada en cromosomas o tejidos.
e) Lavados selectivos que remuevan las sondas que no hibridan.
Clonación
Es la manipulación genética que permite
copiar al ADN in vivo produciendo numerosas
moléculas idénticas o clones del mismo. Con
las técnicas de biología molecular actuales es
posible aislar un ADN con la secuencia de
interés y propagarlo en un organismo
adecuado. Esto permite obtener cantidades
ilimitadas del gen de interés, lo que facilita
enormemente su estudio.
ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN
Las ER son endonucleasas que reconocen
una secuencia de entre 4 - 8 pb en una
molécula de ADN de doble hebra. El sitio
de reconocimiento se llama sitio de
restricción y la enzima rompe un enlace
fosfodiéster en la hebra guía y otro
enlace fosfodiéster en la hebra
complementaria.
Las nucleasas son enzimas que poseen
todos los organismos vivos, cuya función
es degradar el ADN o ARN mediante la
digestión, es decir el corte de su cadena
en puntos mas o menos específicos.
Las bacterias son capaces de sintetizar
una amplia gamma de unas nucleasas
llamadas ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION.
Se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción.
Se aprecia la actuación en ambas hebras.
El resultado de la actuación de la enzima de restricción. Ha quedado rota la
molécula de ADN, quedando bordes pegajosos por donde puede
unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie diferente.
Enzimas de Restricción
La función de las enzimas de restricción es la de proteger al organismo del
DNA extraño. Cuando una porción de DNA foráneo ingresa a la célula, las
enzimas de restricción se encargan de degradarlo cortándolo en pequeños
fragmentos, siempre y cuando éste no esté modificado.
Secuencias Palindromicas:
Secuencias determinadas de 4-8
nucleótidos, que tienen la misma
lectura en una hebra y en la
complementaria en la misma dirección.
Por ejemplo:
5’ACCTAGGT3’
3’TGGATCCA5’
TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION
• Sistemas tipo I
Una sola enzima (multimérica que posee 3 sub-unidades) reconoce la secuencia específica de ADN,
metila y restringe. Pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y
en sitios distantes al de reconocimiento por ello no se suelen emplear para ADN recombinante.
Cortan en un sitio cercano al sitio de restricción.
• Sistemas tipo II
Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de
reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en genética molecular puesto
que permiten romper el ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas.
• Sistemas tipo III
Es similar al sistema tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas
que solo cortan entre nucleótidos del mismo tipo por ej. entre dos adeninas. Utilizan una enzima
oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 pb, más allá del
sitio de reconocimiento.
PRINCIPALES ENZIMAS DE RESTRICCION
Enzimas de Restricción
TIPOS DE CORTES
1. Cohesivos o pegajosos: dejando productos con extremos
complementarios. Ej. Eco RI y Pst I
GAATTC GGATCC AAGCTT
CTTAAG CCTAGG AACGAA
EcoRI BamHI HindIII
2. Abruptos : dejando productos con extremos ciegos Ej: Pvu
II
AATAAT CCCGGG
TTATAA GGGCCC
Sspl Smal
Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.
Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros
fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción.
APLICACIONES DE ENZIMAS
RESTRICCIÓN
1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o
bacteriófago.
2. Fragmentar ADN genómico para la separación de
electroforesis y “Southern blot”.
3. Generación de fragmentos para ser usados como
sondas marcadas en “Southern” y “Northen”
Blotting.
4. Generación de fragmentos para ser subclonados en
los vectores apropiados, creación del ADN
recombinante.
USOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION
En ingeniería genética, los biólogos
moleculares utilizan estas ER para
aislar segmentos de ADN que
contiene un gen de interés.
Un plásmido extraído de su bacteria
y tratado con la misma ER puede
formar un híbrido con estos
extremos ‘pegajosos' de ADN
complementario.
El plásmido híbrido se reincorpora
a la célula bacteriana, donde se
replica como parte del ADN celular.
Se puede cultivar un gran número
de células hijas y obtener sus
productos genéticos para uso
humano.
CISH: Chromogenic in situ hybridisation
HIBRIDACION IN SITU POR FLUORESCENCIA (FISH)
La técnica del FISH es un procedimiento de citogenética molecular que se fundamenta
en el uso de sondas ADN dirigidas específicamente para reconocer secuencias
conocidas del ADN cromosómico (Hibridación) y su posterior visualización mediante la
fluorescencia, puesto que las sondas están marcados con fluorcrómos.
La hibridación in situ es una técnica de gran sensibilidad que permite detectar y
localizar secuencias específicas de ácidos nucleícos en cromosomas, células y tejidos
preservados morfológicamente.
La técnica utiliza fragmentos de ADN o ARN marcados (sondas), que hibridan
específicamente con sus secuencias complementarias de ADN presentes en
cromosomas, células interfásicas y mitocondrias o ARN citoplásmico, formando
híbridos estables que luego pueden ser detectados.
FIS
H
La posibilidad de clonar ácidos nucléicos y la mejora de las técnicas de marcaje han permitido
que la hibridación in situ, que hasta hace poco era una técnica sólo accesible a laboratorios
de investigación, se utilice rutinariamente en hospitales para diagnóstico y seguimiento de
muchas enfermedades.
En estos últimos años el marcaje de las
sondas ADN con fluorcromos han
permitido desarrollar la metodología del
FISH la que se basa principalmente en la
hibridación in situ.
Este método emplea la capacidad que
tiene la Sonda de ADN de encontrar en
algún lugar del genoma, una secuencia de
ADN complementario y de unirse ó
hibridizar específicamente con ella.
FISH
La visualización de la señal emitida por estos fluorcromos es facilitada por la tinción de los
núcleos en interfase y metafases con un medio de montaje que contiene tinción de contraste. Se
utilizan como contraste el Ioduro de Propidium cuando se emplea la Fluoresceína y el 4,6-
diamino-2fenil-indol (DAPI) para la Rodamina.
La especificidad y utilidad del FISH va ha depender del problema a resolver y de la sonda elegida.
La técnica consiste en preparar
cortas secuencias de DNA de una
sola hebra, llamadas sondas, que
son complementarias de las
secuencias de DNA que se quieren
marcar y examinar. Estas sondas se
"marcan“ con moléculas
fluorescentes. Esta sondas se
hibridan o unen al DNA
complementario y, como están
marcadas con moléculas
fluorescentes, permiten localizar las
secuencias en las que se
encuentran. A diferencia de otras
pruebas utilizadas para estudiar los
cromosomas que requieren que las
células se encuentren en división
activa, la hibridación fluorescente in
situ puede ser llevada a cabo en
células en interfase.
Tipos de Sondas utilizadas en FISH convencional
Se distinguen 4 tipos de sondas, en función de las estructuras que son capaces de detectar en
el núcleo o en metafase:
• Sondas específicas de gen o locus
• Sondas centroméricas
• Sondas teloméricas
• Sondas de pintado cromosómico
Sondas locus específica Síndrome Di George
Del (22)(q11.2)
24 genes
Estas sondas hibridan pueden reconocer un
gen, incluso una parte de él (desde 1000 pb
hasta 0.3 Mb).
Se conocen como sondas LSI (locus specific
identifier).
Flourescent in situ hybridization (FISH) analysis of a normal individual (D) and patient with a chromosome 22 deletion
using a probe for the UFD1 gene. The patient has only one copy of UFD1 seen in blue (white arrows). Chromosome 22
was labeled with a red fluorescent marker (yellow arrows).
Sondas centroméricas
Identifican los centrómeros (cen), los cuales a pesar de ser prácticamente idénticos
para todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que permite
que la mayor parte de los centroméros individuales pueden ser distinguidos.
Se conocen como sondas CEP (Chromosome enumeration probe).
. El núcleo de la izquierda se ha hibridado
con sondas para los cromosomas 13
(verde) y 21 (rojo). El núcleo de la derecha
se ha hibridado con sondas para los
cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y
(rojo). Puesto que hay dos señales
correspondientes a las sondas de 13, 18 y
21, y una sola señal de cromosomas X e Y,
este feto es un varón, normal con
respecto a la prueba de aneuploidía
Esta prueba de aneuploidía muestra un
feto femenino con trisomía 21. El núcleo
de la izquierda se ha hibridado con
sondas para los cromosomas 13 (verde) y
21 (rojo), y tiene claramente tres señales
rojas. El núcleo de la derecha se ha
hibridado con sondas para los
cromosomas 18 (azul claro), X (verde) e Y
(rojo). Puesto que muestra dos señales
verdes y ninguna roja, es femenino.
Sondas de pintado cromosómico
Son sondas complejas de ADN, generadas a
partir de cromosomas microdiseccionados que
se amplifican por DOP-PCR (Degenerate
Oligonucleotide Primer- PCR), se marcan e
hibridan con múltiples secuencias del
cromosoma, con excepción de las regiones
centroméricas y teloméricas. Así, tras la
hibridación aparece pintado uniformemente
todo el cromosoma.
Son conocidas como sondas WCP (whole
chromosome painting)
Caracterización de un cromosoma 7 estructuralmente anormal en un paciente con
una translocación desequilibrada. Una sonda para cromosoma 17 (sonda “painting”)
se aplicó a células en metafases de sangre periférica, tanto cromosomas 17
normales hibridaron por completo, y el material no identificable unido al
Sondas de pintado cromosómico. En verde: cromosoma brazo corto 7 (flecha) también está pintado. El paciente es, por lo tanto,
Cromosoma X. En rojo: Cromosoma Y trisómico parcial para el cromosoma 17.
FISH
Actualmente existe la
tecnología necesaria para el
análisis automático de
imágenes, que permite la
utilización simultánea de
multitud de sondas marcadas
con mezclas de fluorcromos
(Fish Multicolor) que son
percibidas como colores
diferentes por el analizador,
aunque son distinguibles por el
ojo humano.
Esta tecnología permite
hibridar todos los cromosomas
simultáneamente,
obteniendose un cariotipo de
24 colores, o incluso obtener
un patrón de colores
asignando diferentes
combinaciones de fluorcromos
a sondas de regiones
cromosómicas diferentes.
ESTACION DE TRABAJO DE FISH
CANCER DE VEJIGA - UROVYSION
