Biorreactores

Ing. Rafael Olivero Verbel

INFLUENCIA DEL MEDIO EN EL CRECIMIENTO CELULAR.

• Los microorganismos necesitan:

Carbono
Nitrógeno
Minerales Biomasa
Factores de Microorganismos
Biosíntesis y
crecimiento mantenimiento celular
Agua
Oxígeno(aerobios)

Condiciones medioambientales:
pH, Temperatura...
Control del
crecimiento
microbiana
Irradiación de alimentos
•Fuentes, intensidad y dosis

•Actividad (A): número de fotones que emite la fuente en la unidad de

tiempo
•Intensidad (I): número de fotones que alcanzan al objetivo en la
unidad de tiempo y por unidad de superficie
•Dosis (D): Cantidad de ENERGÍA absorbida por unidad de masa

Actividad de la Dosis Dosis biológica Intensidad

fuente absorbida efectiva

Unidad Curie Rad Rem Roentgen

antigua
Unidad SI Becquerel Gray Sievert ...
 Irradiación de alimentos •Energía: según isótopo
•Se escoge radiación g
•Intensidad: fija, regulable por ventanas
•Fuentes, intensidad y dosis
De isótopos radioactivos
•Energía regulable
•Intensidad regulable
•Sólo se pueden acelerar partículas con
Aceleradores de electrones carga
•¿Qué es 1 mSv?
•Y un miliSievert (mSv)

Rayos Gamma 60
Co 1,25 Mev
137
Cs 0,66 Mev

Rayos X Acelerador de e- <5 Mev

Electrones acelerados Acelerador de e- <10 Mev
Irradiación de alimentos

•Radiaciones ionizantes
•Son radiaciones de energía suficiente para romper enlaces
covalentes
•1 megaelectron volt = 1.60217657 × 10-13 joules

•“Ionizantes” porque a menudo tienen fuerza para arrancar

electrones de enlace completamente

•Esto se cumple para energías superiores a 0,5 MeV

•El límite superior es 10 MeV, para evitar la radioactividad inducida

Radura y radiación
 AGENTES FÍSICOS

TINDALIZACIÓN O ESTERILIZACIÓN
FRACCIONADA POR VAPOR

Consiste esencialmente en exponer el material que necesitamos esterilizar, a los

vapores del agua ebullendo. Este proceso se puede llevar al cabo en el autoclave
sólo que dejando las válvulas de escape abiertas; el proceso puede ser continuo o
intermitente en varios días consecutivos.

Condiciones: 90-100ºC / 20 a 30 minutos durante tres

días consecutivos. Se incuba a 37ºC entre cada
calentamiento
 Efecto De Las Radiaciones Sobre Los Microorganismos

RADIACIÓN:
Es una forma de propagación de la energía a
través del espacio

Electromagnética
Rayos X, rayos gamma, ultravioleta, visible,
infrarrojos, ondas hertzianas
Particulada
Rayos beta (e- de alta velocidad), rayos alfa
(núcleos de helio) o neutrones.
 Rayos gamma y Rayos catódicos

• Rayos gamma
• Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitidas por ciertos isótopos
radiactivos como es el Co60.
• Son difíciles de controlar porque este isótopo emite constantemente los rayos en
todas direcciones.
• Estos rayos pueden penetrar materiales, por lo que un producto se puede
empaquetar primero y después esterilizar.
• Rayos Catódicos
• Radiación con haz de electrones
• Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros
materiales.
• Ventaja: el material se puede esterilizar después de empacado (ya que
éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambiente.
 • Mantener la pureza del inóculo.
• Esterilizar el medio de cultivo y los aditivos.
• Esterilizar el material en contacto con el medio
Mantenimient ( recipiente, fermentador, válvulas y conductos)
• Esterilizar los gases entrantes y salientes.
o y • Mantener las condiciones asépticas durante la
esterilización manipulación.
• Construcción apropiada del biorreactor para su
esterilización y para la prevención durante la
fermentación.
 Valor D, Z, F y C

Para asegurar esta calidad higiénico-sanitaria, en la industria hay que tener en cuenta los
siguientes valores en el tratamiento térmico empleado:

Valor D: es el tiempo, a una temperatura determinada, para reducir a la décima parte el

número de microorganismos.

Valor Z: es la subida o el descenso de la temperatura que permite aumentar o reducir en

un 90 % los microorganismos, sobre un objeto determinado en un tiempo concreto.

Valor F (valor esterilizante): es el tiempo que se requiere, a una temperatura

determinada, para reducir la población microbiana presente en un alimento hasta un nivel
deseado.
Valor C (valor de cocción): es la letalidad que estima la destrucción de las características
organolépticas del producto. Es importante controlar esto para que el alimento no pierda
calidad organoléptica (textura, sabor, olor, etc).
Valores D y z para microorganismos patógenos asociados a alimentos

Microorganismo Substrato D (°C) Minutos z (°C)

Clostridium botulinum buffer fosfato D121 = 0.204 10

Clostridium perfringens Medio de cultivo D90 = 3–5 6–8

(cepa resistente al calor)

Salmonella Pollo D60 = 0.39–0.40 4.9–5.1

Staphylococcus aureus Pollo D60 = 5.17–5.37 5.2–5.8

Pavo D60 = 15.4 6.8
0.5% NaCl D60 = 2.0–2.5 5.6
Dosis de radiación absorbida: 1rad = 100erg/g
100 rad = 1Gray (Gy)
Especie biológica D (Gy)

Clostridium botulinum 3300

(G+, esp., anaerob.)

Bacillus subtilis 600

(G+, esp., aerob.)
Salmonella 200
(G-)
Lactobacillus 1200
(G+)
Deinoccocus 2200
radiodurans
(G+)
Aspergillus 500
(hongo)
Saccharomyces 500 Fig. 1. Fracción de supervivencia celular (%) de la cepa D7 de S.
(levadura) cerevisiae frente a radiación gamma.

Dosis letal para humanos: 10 Gy

AGENTES
FÍSICOS
ESTERILIZACIÓN EN HORNO Y AUTOCLAVE
CONTROLES

Attest™ Biological
Indicators

Viales con Bacillus

stearothermophilus
AGENTES FÍSICOS

ESTERILIZACIÓN EN HORNO Y AUTOCLAVE

CONTROLES

Attest™ Biological
Monitoring System
AGENTES FÍSICOS

ESTERILIZACIÓN EN HORNO Y AUTOCLAVE

CONTROLES

Autoclave Steam Indicator

Tape
AGENTES FÍSICOS

ESTERILIZACIÓN EN HORNO Y AUTOCLAVE

CONTROLES

Tirillas de papel cromatográfico impregnadas con

esporas de Bacillus subtilis var Niger o Bacillus
stearothermophilus
Bioreactores
 Equipo donde se realiza el
proceso se denomina
biorreactor o fermentados

Biorreactores
 • Un biorreactor es un recipiente o sistema que
mantiene un ambiente biológicamente activo.
• Este proceso puede ser aeróbico o anaeróbico.
Biorreactor Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos,
variando en tamaño desde algunos mililitros
hasta metros cúbicos y son usualmente
fabricados en acero inoxidable.
Fermentación y Cultivo

Una fermentación es un Un cultivo también es un

proceso biológico o bioproceso bioproceso, pero generalmente
que consiste en la se asocia a organismos o
descomposición de la materia microorganismos superiores (en
orgánica por microorganismos orden jerárquico) a las
fermentadores (bacterias y bacterias; los cultivos son casi
hongos). todos del Reino Eucariota.
Biorreactores
 Biorreactor

• Se busca mantener las mejores condiciones ambientales al organismo o sustancia

química.
• En función de flujos de entrada y salida.
• 3 tipos:
• Por Lote (Batch)
• Lote alimentado
• Continuo o quimiostato
Diseño de biorreactores

• Las condiciones ambientales de un biorreactor tales como flujo de gases

(por ejemplo, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, etc.),
temperatura, pH, oxígeno disuelto y velocidad de agitación o circulación,
deben ser cuidadosamente monitoreadas y controladas.
Diseño de biorreactores

• El cilindro debe ser perfectamente esterilizable y limpiable.

• Los biorreactores industriales usualmente emplean bacterias u otros
organismos simples que pueden resistir la fuerza de agitación.
• Siendo fáciles de mantener ya que requieren sólo soluciones simples
de nutrientes y pueden crecer a grandes velocidades
 Biorreactor

El proceso debe ser llevado a cabo

con:
• Economía
• Alto rendimiento
• Menor tiempo posible
Biorreactor: cultivos

• La cinética biológica depende de las características intrínsecas

del organismo o del cultivo:

• Crecimiento celular
• Velocidad de crecimiento
 • Velocidad de crecimiento:
• Cambio en el número de células o en la
masa celular en un determinado tiempo.
Cinética de
crecimiento • Tiempo de duplicación o generación
• Tiempo necesario para que una
población se duplique
• Varía entre cada microorganismo
 Curva de crecimiento
microbiano

• 4 fases
• Distinta para cada
microorganismo
Fase de latencia o lag
• Fase de adaptación a las condiciones ambientales
• Duración variable
• Se sintetizan proteínas y ARN
• Duplicación insignificativa

• Ocurre cuando se transfiere un inoculo desde un medio rico a un

medio más pobre.
Fase exponencial

• Duplicación celular
• Actividad metabólica
• Estado fisiológico más sano
• Velocidad de crecimiento variable
• Condiciones medio ambientales
• Genética
• Se alarga hasta que se agotan los nutrientes
Fase estacionaria

• El número de células viables es igual número de células muertas

• Nutriente limitante
• Productos de desechos
 Fase de muerte

• La muerte celular se vuelve exponencial

• Canibalismo
• Autolisis bacterianas
Cinética de
crecimiento
Biorreactor: objetivos
• Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de
cultivo.
• Mantener constante y homogénea la temperatura.
• Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
• Mantener el cultivo puro.
• Mantener un ambiente aséptico.
• Maximizar el rendimiento y la producción.
• Minimizar el gasto y los costos de producción.
• Reducir al máximo el tiempo.
 Parámetros a controlar

• Temperatura:
• Afecta el crecimiento del cultivo de microorganismos o celular.
• Conforme aumenta la temperatura
• Por encima de la temperatura máxima.
• Sensores
• Laboratorio: intercambiador de calor
Automatización
Parámetros a controlar
• pH
• El rango normal de acidez es de 2,0 ≥ pH ≤ 10,0.
• El pH es controlado por el metabolismo celular.

• Levadura: 3,5-5,5
• Bacterias 6,0 y 7,5
• Equipos:
• Condensador de acidez
• Condensador de alcalino
• Bombas peristálticas con mangueras de siliconas
Control
Parámetros a controlar
• Espuma
• Densas y jabonosas : productos oxidados
• Problemas funcionales
• Contaminación del cultivo
• No se pueden realizar bien las mediciones
• Solución:
• Antiespumante
• Controlador
• sensor
Criterios utilizados en la formulación del medio

CONTROL DEL PROCESO:VARIABLES.

1.-pH
2.-ESPUMA
3.-OXÍGENO
4.-TEMPERATURA
5.-REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DE PRODUCTO.
pH:
• Control necesario para el desarrollo celular y formación de producto.
• Control de forma indirecta o de forma directa:
• Directamente (Añadiendo agentes tamponantes):
• Fosfato inorgánico pH entre 6.0 y 7.5.
• Ácidos orgánicos pH bajos.
• Carbonato cálcico frente a la producción de ácidos.
• Hidroxisales, amoniaco, ácidos sulfúrico y clorhídrico.
• Indirectamente ( mediante un balance equitativo entre las fuentes de carbohidrato
y nitrógeno).
• Los carbohidratos bajan el pH (formación de ácidos orgánicos).
• Asimilación del nitrato alcalinidad.
• DESVENTAJAS: Efectos represivos sobre la formación del producto.
ESPUMA

• ORIGEN:
Desnaturalización de las proteínas en la
interfase gas- líquido.
• PROBLEMAS:
Ascender hasta ocupar totalmente la cabeza
del fermentador. Evacuar parte del
contenido del aparato por la salida del aire.
• SOLUCIÓN:
Antiespumantes ( agentes tensoactivos que
reducen la tensión superficial de las espumas
hasta dispersarlas ).
Rompedores mecánicos.
 ANTIESPUMANTE

• Eficacia (Depende de las condiciones de fermentación):

• Composición del medio, cepas microbianas, etapa de crecimiento, configuración de las vías de
aireación y del fermentador.
• Selección y cantidad del antiespumante:
• Procedimientos de ensayo y error.
• Uso de soportes(aceites orgánicos y minerales)
• Cantidad de antiespumante mínima ( afecta a la velocidad de transferencia de oxígeno hasta u
50%)
• No deben ser tóxicos ni peligrosos, esterilizables por el calor y baratos.
OXÍGENO.

• Requerimientos en procesos aerobios.

• Influencia sobre los procesos metabólicos.
• Velocidad de absorción específica de oxígeno concentración de
oxígeno disuelto
• Antioxidantes como protección del producto.
TEMPERATURA:

Temperatura
óptima para la Uso de
producción celular termostatos
o de metabolitos.
REGULACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL
PRODUCTO.

• INDUCTORES
• incorporarse al medio el inductor específico
• mediante adiciones continuas o discontinuas
• INHIBIDORES:
• minimizar la formación de otros intermedios metabólicos.
• Prevenir el metabolismo posterior al producto deseado
• Ejemplos:
• Fuente de N utilizable rápidamente inhibe la producción de algunos
antibióticos.
• El ácido fenilacético es el ppal percusor en la producción de
bencilpenicilina por fermentación.
 Tipos de biorreactores
• Dos tipos de biorreactores de uso
muy difundido: el tanque “agitado”
y al "air lift".
• En el primero de ellos la agitación
se realiza mecánicamente mediante
un eje provisto de turbinas
accionado por un motor.
Tipos de
biorreactores
• Reactor de tanque agitado:
• Más utilizados
• Confiables
• Sistema de agitación mecánica
 Características

• Agitación continua
• Inyección de aire por la parte inferior
• Burbujas: difusión de oxígeno

• Contiene vanos de flectores:

• Mejor mezclado
• Sistema de calor por fuera
 Sistema de agitación:

• Generar la potencia necesaria para producir una

mezcla perfecta para el sistema de cultivo

• Maximizar la difusión de gases en el líquido y

minimizar la producción de esfuerzos cortantes y
la presión hidrodinámica local y global, para
optimizar los fenómenos de transferencia de
momentum, calor y masa.
Componentes sistema de agitación

Eje de transmisión
de potencia Rotor

Motor en pedestal
Para próxima Clase
Reactor “air lift”

• La agitación la entrega el aire

proporcionado
 reactores de tipo
"air lift"
• El aire que ingresa al biorreactor debe
estar estéril, lo que se consigue haciéndolo
pasar por un filtro cuyo diámetro de poro
es de 0,45 micrones, que impide el paso
de microorganismos y esporas.
 Modos de operación
• Quimiostato o cultivo continuo
• Se mantiene por un tiempo indefinido

• Existe un flujo continuo de reactivos frescos hacia el reactor y el producto

fluye continuamente hacia fuera.

• Se compone de:
• Un reactor con un volumen de cultivo constante
• Entrada de nutrientes constante
• Salida biomasa
Modos de operación
• Pasos:
• Cargarse con ínóculo de cultivo
• Agregar medio de cultivo fresco
• Lavar (flujo de salida)
• Mantener el volumen constante

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la

concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y
entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las
células creciendo exponencialmente.
Sistema continuo

• En un sistema continuo con mezcla completa, las condiciones son

uniformes en todo el reactor, en un equilibrio de mezcla de
nutrientes, organismos y productos.
• La alimentación del sistema es medio nutriente libre de organismos y,
en algunos casos, un inóculo de organismos reciclados.
Cultivo por
Lote (Batch)
Cultivo por Lote (Batch)

• El reactor se carga con la especie reactiva y, a medida que procede la

reacción, cambian las condiciones en el reactor al consumirse los
reactivos y formarse los productos.
• Cuando se ha alcanzado el nivel deseado de reacción, se vacía el
reactor, se limpia y el proceso se repite.
Cultivo por Lote (Batch)

• El crecimiento exponencial es de duración limitada

• A medida que las condiciones nutricionales cambian, la velocidad de
crecimiento disminuye y se entra en la fase de deceleración, seguida
de la fase estacionaria, donde el crecimiento global no se obtiene, por
falta de nutrientes.
Ventajas

• menor riesgo de contaminación

• flexibilidad operacional cuando los fermentadores se utilizan para
distintos productos
• control más cercano de la estabilidad genética del organismo
• una mejor coordinación con estadios del proceso entre lotes previos y
posteriores.
Desventajas

• Improductividad en la operación del fermentador

• Los fermentadores deben ser vaciados, limpiados, esterilizados y
recargados antes de cada fermentación, operaciones todas
esenciales pero no productivas.

• En un proceso continuo, por el contrario, una corrida puede durar

semanas o meses, es decir que el tiempo no productivo es, en
proporción, pequeño
 Diauxia

• Si el medio contiene dos fuentes de C diferentes, las bacterias

tienden a utilizar aquella que les proporcione mayor rendimiento
energético. Cuando ésta se acaba, hay un tiempo de adaptación al
segundo substrato que, a continuación, es consumido.
• El rendimiento y velocidad de crecimiento es mayor para el primer
substrato que para el segundo.
 • Los reactores impulsados por aire " airlift"
utilizan aire para satisfacer la demanda
bioquímica de oxfgeno DBO, la demanda
airlift química de oxlgeno DQO, impulsar el
contenido del reactor y satisfacer las
necesidades de aeración y agitación en los
cultivos aeróbicos
AIR-LIFT
Air - lift
 CONSTRUCCION DE UN FERMENTADOR

 Tamaño
 Configuración
 Modo de operación
batch fed batch continuo

 Monitoreo o control
 Configuration mecánica o estructural
 CARACTERÍSTICAS DE
UN FERMENTADOR

 Elevada productividad comercial

 Reducido costo
 Uniformidades de calidad
 Reproductibilidad
 Fases de formación de biomasa (BATCH)
X
fase
lag-fase
exponencial fase estacionaria

fase de
desaceleración

tiempo t
Quimiostato
• Suministramos nutriente esencial limitante a medida que va siendo
necesario.
• Se va eliminando biomasa para formarse biomasa nueva.
• La densidad y rapidez de crecimiento se mantiene constante, debido a
que la cantidad de substrato y de producto también se mantienen
constantes.
Quimiostato

• Esquema del
fermentador
Quimiostato
• La rapidez de crecimiento depende del tipo de nutriente limitante
• Carbono
• Nitrógeno
• Fósforo
• Vitamina
• Los demás nutrientes esenciales están presentes en exceso.
Turbidostato
• El producto no se saca del reactor
• Tenemos un circuito de reflujo, que acoge el producto cuando hay
exceso, de ese modo se mantiene constante la velocidad
• La cantidad de producto que hay en el reflujo, determina la cantidad
de medio que se añade al biorreactor
 El segundo tipo de cultivo continuo es el turbidostato

• Se ajusta la velocidad de dilución de tal forma que la densidad óptica

del cultivo se mantiene constante.

• Turbidostato el medio de cultivo no contiene nutrientes limitantes

Turbidostato
• Se dice que es un sistema de control interno porque es la misma
concentración de bacterias la que regula el flujo de entrada y de
salida (por medio de un mecanismo electrónico basado en la
medición y control de la densidad óptica del cultivo).
Turbidostato

• Esquema del
turbidostato
Flujo pistón ideal
 Sistemas de cultivo

Los procesos fermentativos pueden dividirse

básicamente en 2 grandes grupos

Fermentaciones líquidas sumergidas (FLS)

Contenido de agua del medio 90-95 %

Fermentaciones en sustrato sólido (FSS)

El medio son partículas húmedas con ausencia o casi ausencia
de agua libre
Reactores empleados en fermentaciones líquidas
sumergidas
Fermentación en sustrato sólido

Hay dos formas básicas de cultivos sólidos

Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos
agroindustriales)
Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo
(inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano)

Comparación a
nivel de
microescala
entre FLS y FSS
Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato sólido
Comparación entre FSS y fermentación líquida sumergida

FSS Fermentación sumergida

Medios con mayor cantidad de ingredientes,
Medios simples. Requieren adición de agua o una
mayor costo. Buena reproducibilidad en medios
solución mineral. Sustratos variables
definidos

Bajo øH20 reduce riesgos de contaminación Mayores riesgos de contaminación

Medios diluídos, Volúmenes de fermentación

Medios concentrados. Elevada concentración de grandes. Altas concentraciones de medio puede
producto Menor volumen de reactor afectar crecimiento. Alimentación de sustrato es
común

Menor consumo de energia para aerear Transferencia G-L es generalmente limitante

Mezclado intenso.
Mezclado imperfecto o casi imposible. Difusión
La difusión de nutrientes es generalmente no
puede limitar el proceso
limitante

Remoción de calor es crítica. Transferencia de

Alto contenido de agua facilita control de T ra
calor por evaporación puede ser importante

Control del proceso dificultosa. Amplio desarrollo en sistemas de medición y

Estimación de biomasa no es directa control

Downstream processing simple. Contaminación La remoción de grandes volúmenes de agua

de producto con componentes del medio es alta aumenta costos en los procesos de separación y
Bajos volúmenes de efluentes líquidos purificación

Cinética y fenómenos de transporte poco

Modelos cinéticos y difusionales
conocidos
 Consideraciones en el diseño y selección de un
fermentador
• El envase o contenedor en donde se realizará la
fermentación debe ser capaz de ser operado
asépticamente.
• La aireación (o ausencia de esta) y la agitación deben
realizarse de forma que se cumplan con los requerimientos
metabólicos del microorganismo utilizado.

• El aire debe estar filtrado para evitar la entrada de

microorganismos en el polvo.
Consideraciones en el diseño y selección de
un fermentador
• El consumo de energía debe ser bajo

• Un sistema de control de temperatura debe ser provisto

en prácticamente todas las operaciones controladas.
La temperatura es un factor sumamente importante en
todos los procesos de fermentación
 Consideraciones en el diseño y selección de un
fermentador

• Control de pH
• Muestreo eficiente y que no promueva la contaminación del proceso.
• Mínimas perdidas por evaporación
• El diseño del envase (o tanque) debe considerar un fácil manejo para las
operaciones de limpieza y mantemimiento.
• Las paredes del envase (o tanque) deben ser pulidas, es decir, no deben
tener porosidad que dificulte la limpieza y sanitización.
 Consideraciones en el diseño y selección de
un fermentador

• Los materiales de construcción

• Fermentadores industriales