Introducción
*Cromatografía gas-sólido(GSC), de aplicación limitada
*Cromatografía gas líquido(GLC) o (GC), de gran aplicación en todos los
campos de la ciencia
La cromatografía gas-sólido se fundamenta en una fase estacionaria sólida en la
cual se produce la retención de los analitos como consecuencia de la adsorción
física. No ha encontrado gran aplicación, excepto para la separación de ciertas
especies gaseosas de bajo peso molecular. Esta aplicación limitada se debe a la
retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de
picos de elución con colas(una consecuencia del carácter no lineal del proceso de
adsorción)
La cromatografía gas-líquido se fundamenta en la distribución o partición del
analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la
superficie de un sólido inerte
En cromatografía gaseosa la elución del analito se produce por el flujo de un gas
inerte (fase móvil), que no interacciona con el analito, su única función es la de
transportar al analito a través de la columna.
los principales componentes en un sistema de cromatografía gaseosa son: la fuente de gas
portador, el sistema de inyección (inyector, divisor de flujo, septum y jeringa), el horno que contiene
la columna, el detector y el sistema de registro e integración.
Cómo funciona el cromatógrafo gaseoso?
La muestra se vaporiza en el sistema de inyección y es transportada
por la fase móvil gaseosa (gas carrier o portador) a través de la
columna..
El reparto o partición de los componentes de la muestra en la fase
estacionaria, se basa en sus diferentes solubilidades en esta fase a
una temperatura dada. Por lo tanto, los componentes de la mezcla
(solutos o analitos) se separan entre sí de acuerdo a sus afinidades
(solubilidad)con la fase estacionaria y en base a sus presiones de
vapor relativas
En resumen, un cromatógrafo de gases funciona de la siguiente forma:
Un gas inerte fluye en forma continua desde un cilindro de gas a
través del inyector, la columna y el detector.
La velocidad de flujo del gas carrier se controla para asegurar tiempos
de retención reproductibles y minimizar las variaciones y ruidos en
el detector.
La muestra se inyecta (normalmente con una micro jeringa) en el
inyector que se encuentra a alta temperatura donde se vaporiza y
es transportada a la columna, en general de 15 a 30 m de largo,
cubierta en la parte interior por un film de un líquido de alto punto
de ebullición (la fase estacionaria).
La muestra se reparte entre la fase móvil y la estacionaria de modo de
que los componentes individuales se separen en base a su
solubilidad relativa en la fase líquida y sus presiones de vapor
relativas.
Luego de la columna, el gas carrier y la muestra pasan a través de un
detector, donde se mide la cantidad de cada componente y se genera una
señal eléctrica. Esta señal se transmite a un sistema de registro e integración,
el cual genera un cromatograma que representa un registro del análisis.
En la mayor parte de los casos, el sistema integra automáticamente el área
de cada pico, realiza los cálculos e imprime un reporte con los resultados
cuantitativos y los tiempos de retención.
Como producto de una cromatografía instrumental, obtenemos siempre un
Cromatograma
Un cromatograma es: un gráfico, que relaciona en las ordenadas,
la respuesta del detector(al analito) y en las abcisas el tiempo o
volúmen(más comunmentese utiliza el tiempo (en min.)
Cromatograma
tiempo de
retención (tR)
Un cromatograma es un gráfico que relaciona en general, en ordenadas la respuesta
del detector(al analito) y en abcisas el tiempo (min)
respuesta del detector
altura del pico
inyección área del pico
“pico” del solvente
línea de base
tiempo
Gas carrier
La función principal del gas carrier es transportar la muestra
a través de la columna. Es la fase móvil, debe ser inerte en las
condiciones usadas, no debe interaccionar químicamente
con la muestra y ser de elevada pureza.
Una segunda función es actuar como una matriz conveniente
en el detector para la medida de los componentes en la
mezcla.
La selección del gas carrier (portador) dependerá
fundamentalmente del tipo de detector utilizado. Los gases
mas utilizados son nitrógeno, hidrógeno, helio o argón. El
hidrógeno tiene la menor viscosidad de todos, lo que
significa que su uso es ventajoso en columnas capilares
largas en las cuales se requiere flujos relativamente altos.
Control de flujo y su medida
La medida y control del flujo del gas carrier es esencial para lograr una buena
eficacia y resolución y sobre todo para el análisis cualitativo de las mezclas.
La eficacia de una columna depende de la velocidad del flujo, la cual se puede
cambiar hasta lograr el máximo número de platos teóricos.
Para el análisis cualitativo de mezclas es esencial tener una velocidad de flujo
constante y reproductible de forma que los tiempos de retención también sean
reproductibles.
La comparación de los tiempos de retención es la técnica mas rápida y sencilla
para la identificación de componentes.
Se debe tener en cuenta de que 2 o más compuestos pueden presentar el mismo
tiempo de retención, pero ningún componente puede presentar 2 tiempos de
retención diferentes en las mismas condiciones instrumentales.
Por lo tanto, el tiempo de retención es una característica de cada soluto.
Obviamente un buen control de flujo es esencial para este método de
identificación.
Análisis cualitativo
Objetivo: identificar los componentes presentes en la muestra
Metodología:
-comparación de los tiempos de retención del problema (tR,x) con los de estándares
(tR,s)
-complementar información estructural con métodos espectroscópicos (MS, NMR,
IR, UV)
tR,s1
S2
S1 estándares
S3
Conclusión:
tR,s1 X = S1 sólo con confirmación
espectral
X
problema
Sistemas de control de flujo:
El primer sistema de control de flujo esta representado por los
reguladores de dos etapas conectados a los cilindros de gas carrier,
necesarios para reducir la presión del cilindro desde aprox. 2500 psi a un
nivel de 20-60 psi.
Para cromatografía gaseosa isoterma (temperatura del horno constante
durante toda la corrida), la presión de entrada constante es suficiente
para tener una velocidad de flujo constante, asumiendo que la columna
produce una caída de presión constante.
Para cromatografía gaseosa en la que se utilizan programas de
temperatura(con programación de temperatura o en gradiente,la
temperatura de la columna varía durante el proceso cromatográfico), aun
cuando la presión de entrada de la fase móvil es constante, la velocidad
de flujo disminuirá a medida que la temperatura de la columna aumenta.
Esta disminución de la velocidad de flujo es debida al aumento de la
viscosidad del gas carrier a temperaturas elevadas. En todos los
cromatógrafos de temperatura programada, se debe utilizar un
controlador diferencial de flujo que asegure una velocidad de flujo
constante.
Medidores de flujo
El sistema más común utilizado en
la medida de flujo de la fase móvil,
esta representado por un flujímetro
que utiliza burbujas de jabón
líquido. Se trata de un tubo
calibrado a través del que se
permite fluir el gas carrier. Se
forman burbujas en el jabón con
una pera de goma en la parte Gas desde el
GC
inferior del tubo y al pasar el gas jabón
desde el cromatógrafo arrastra
estas burbujas que recorren una
distancia (volumen) en un
determinado tiempo indicando una
determinada velocidad de flujo
(mL/min).
Sistemas de inyección
La muestra a ser analizada por cromatografía gaseosa puede ser de
diferente naturaleza: gases, líquidos y sólidos. En consecuencia, el
sistema de inyección debe contemplar estas características y permitir
que la muestra sea introducida al cromatógrafo en forma rápida (como
un tapón de vapor) y cuantitativa. La inyección lenta de muestras
demasíado grandes provoca un ensanchamiento de las bandas y una
mala resolución.
El método más común de inyección de muestra implica el uso de una
microjeringa para inyectar una muestra líquida o gaseosa a través de un
diafragma o “septum” de goma de silicona, en una cámara de
vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara
de muestra normalmente
está a unos 50ºC por encima del punto de
ebullición del componente menos volátil de
la muestra)
La eficacia de la columna requiere que la muestra sea de un tamaño
adecuado(desde unas pocas décimas de microlitro a 20 microlitros, para
columnas analíticas ordinarias) Para cada caso, se requiere de diferentes
tipos y tamaños de columnas y por lo tanto se dispone de diferentes
sistemas de inyección.
En el caso de columnas capilares deben utilizarse cantidades de muestra
del orden de 10-3, el sistema de inyección mas frecuente, en este caso,
involucra la aplicación de un divisor de flujo (sistema split ).
Este sistema permite la introducción de una cantidad pequeña y definida
de muestra y en la misma sólo una cierta cantidad de la muestra
inyectada llega a la columna, esta cantidad se determina por la relación
de split, la cual normalmente se encuentra en el rango 1:20-1:200.
Dado que el sistema de “split-injection” puede provocar discriminación de
los componentes de mayor punto de ebullición, no siempre puede ser
utilizado con fines cuantitativos, sin embargo es bastante utilizado,
debido a la elevada sensibilidad del equipo, que requiere una inyección
mínima de analito, para no saturar el detector.
La eliminación del divisor de flujo se denomina(sistema splitless).
En todos los casos se debe considerar previamente el uso de jeringas
apropiadas. El material de la aguja es acero inoxidable, al igual que el
émbolo, mientras que el cuerpo de la jeringa es de vidrio
borosilicatado. Un criterio útil en al selección de jeringas, consiste en
utilizar jeringas cuyo volumen total sea al menos dos veces mayor que
el volumen a ser inyectado. En todos los casos y aplicaciones, la
jeringa y sus partes deben ser cuidadosamente limpiadas y enjuagadas
con solventes apropiados entre inyecciones.
Modalidad split (para muestras concentradas)
Características
la muestra se vaporiza en un inyector a alta temperatura
la muestra vaporizada se divide (split) por lo que sólo una parte
conocida de la muestra entra a la columna de separación
la relación normal de split utilizada está entre 1:10 a 1:200
el operador regula fácilmente la relación de split abriendo o cerrando
una válvula y controlando los valores de flujo
Modalidad splitless(para muestras diluídas)
Características:
se inserta en el inyector la jeringa
se cierra la válvula de split
iniciar programa de temperatura de la columna (horno)
Sistemas de inyección automática:
Finalmente, otra técnica es la de “on-column injection”, en la cual la muestra es
introducida directamente , por medio de una jeringa especial, en la columna, sin
calentamiento previo o mezcla con el gas carrier. Inicialmente se utilizaron para
columnas empacadas.
COLUMNAS
Las columnas cromatográficas varían en longitud, aproximadamente desde menos de 2
mt hasta 50 mt o más, se construyen de acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. A
fin de poder colocarse en el interior de un horno termostatizado, normalmente se
configuran como helicoides, con diámetro de 10 a 30 cm.
La columna debe ubicarse en el interior de un horno termostatizado debido a que la
temperatura de la columna es una variable importante y para un trabajo preciso
debe regularse a las décimas de grado.
La temperatura óptima de la columna depende del punto de ebullición de la
muestra y del grado de separación requerido. En la práctica con una
temperatura inicial inferior al punto de ebullición promedio de la
muestra, se obtienen tiempos de elución razonables(2 a 30 min). La
temperatura, en general, se aumenta gradualmente (Con gradiente de tra.)
En cromatografía de gases se usan dos tipos generales de columnas, las:
a) Empaquetadas o de relleno y,
b) Tubulares abiertas o capilares.
Actualmente para la mayor parte de las aplicaciones de la cromatografía gaseosa, se
prefiere utilizar columnas capilares que son más eficaces, rápidas separando y permiten
obtener una resolución muy elevada.
Las columnas tubulares abiertas se caracterizan por un espacio abierto en el
centro. Generalmente tienen directamente cubierta la pared con la fase
estacionaria (WCOT, wall coated-open tubular columns)
soporte sólido
fase líquida
(film 0.2-5 mm)
tubo de sílica
fundida (columna)
diámetro externo 0.3 cm diámetro interno 0.10–0.54 mm
(columna empacada) (columna capilar o WCOT)
WCOT = Wall Coated Open Tubular
Las columnas empacadas contienen la fase estacionaria sobre un soporte
inerte, normalmente tierra de diatomeas, y esta completamente llena.
La decisión más importante en la fijación de los parámetros para un
análisis por cromatografía gaseosa, es la selección de la mejor columna o
fase estacionaria.
La otra decisión importante es la selección de la temperatura de la
columna, pero se trata de una decisión menos crítica debido a la amplia
posibilidad de programaciones que se pueden seleccionar y ensayar.
En la selección de la fase estacionaria es una etapa crítica para el éxito de
la separación y se debe tener en cuenta sobre todo, la Información previa
acerca de la separación requerida - las referencias en la literatura
(publicaciones científicas, manuales de control de calidad, etc) y las notas
de aplicación (referencias obtenidas del proveedor) son fuente de este
tipo de información. Si se encuentran otras columnas disponibles en el
laboratorio, se deben evaluar los resultados al utilizarlas.
Inicialmente las fases estacionarias mas utilizadas para el análisis de
mezclas volátiles complejas eran fases polares del tipo poliglicólico
(polietilenglicol – poliéster) o Carbowax.
Mas adelante han tenido una gran difusión las fases estacionarias
apolares del tipo siliconas (dialquilsiloxanos), y sobre todo las del tipo
SE 52 y SE 54.
Las propiedades ideales para las fases estacionarias inmovilizadas
incluyen principalmente, baja volatilidad, estabilidad térmica e inercia
química. El líquido inmovilizado ha de originar diferentes coeficientes de
distribución, para los distintos solutos. Además estos coeficientes no
deben ser ni extremadamente grandes ni extremadamente pequeños,
dado que los primeros originan tiempos de retención prohibitivamente
largos y los últimos dan como resultado tiempos tan cortos que las
separaciones son incompletas.
Para que una especie tenga un tiempo de residencia razonable en la
columna, debe poseer cierto grado de compatibilidad (solubilidad) con la
fase estacionaria. Aquí se aplica el principio de “lo semejante disuelve a lo
semejante”, donde semejante se refiere a las polaridades del soluto
(analito)y del líquido inmovilizado (fase estacionaria). Cuando la igualdad
es buena, el orden de elución viene determinado por el punto de ebullición
Todas las columnas comerciales de siloxano, se conocen también como columnas
de silicona y las de polietilen glicol, se conocen también como columnas PEG.
Como analitos polares se incluyen los alcoholes, ácidos y aminas.
Especies de polaridad intermedia incluyen éteres, cetonas y aldehídos.
Los hidrocarburos saturados son no polares
Columnas comerciales
Columnas comerciales
Columnas comerciales
Programación de temperatura
La columna se encuentra termostatizada de modo a obtener una buena separación
en un tiempo razonable.
El control de la temperatura de la columna es una de las formas más sencillas y
más efectivas de influenciar la separación de los componentes. La columna se fija
entre un inyector mantenido a una temperatura de inyección, y un detector
mantenido a una temperatura también predeterminada. Por lo tanto, se debe
definir la temperatura a la que cada uno de los componentes opera.
Temperatura del inyector
La temperatura del inyector debe ser suficientemente alta como para vaporizar la
muestra en forma rápida, pero lo suficientemente baja como evitar su
descomposición térmica o rearreglos químicos.
La determinación de los valores óptimos se logra mediante práctica y experiencia.
La temperatura de la columna debe ser lo suficientemente alta como para asegurar
que los componentes de la muestra atraviesen la columna a una velocidad
razonable. Sin embargo, no puede ser mayor que el punto de ebullición de la
muestra; sobre todo al iniciar la corrida cromatográfica, de hecho es preferible
que la temperatura de la columna se encuentre por debajo del punto de
ebullición, y se aumente gradualmente a medida que transcurre el tiempo
Las técnicas utilizadas implican el uso de sistemas isotermas (donde la temperatura
de la columna se mantiene constante) o de temperatura programada (PTGC),
donde la columna se somete a un incremento lineal de la temperatura con el
tiempo.
Efecto de la temperatura de la columna en la separación cromatográfica
Cromatografía gaseosa isoterma
Cromatografía gaseosa con temperatura programada (TPGC)
Temperatura del detector
La temperatura del detector depende fundamentalmente del tipo de detector
empleado. Sin embargo, como regla general la temperatura del detector y la de su
conexión a la salida de la columna, deben ser suficientemente altas como para evitar
la condensación de la muestra. Si la temperatura es muy baja y ocurre condensación,
se producirá ensanchamiento de los picos o la ausencia total de los mismos.
En el caso del detector de ionización de llama, una temperatura mínima razonable es
de 250 ºC.
Detectores
El detector debe ser sensible a los efluentes de la columna y capaz de suministrar un
registro de la cromatografía en la forma de un cromatograma. La señal del detector
debe ser proporcional a la cantidad de cada soluto (analito). Con lo cual debe ser
posible realizar un análisis cuantitativo.
Se han desarrollado una gran cantidad de detectores para monitorear los
componentes que son separados en el efluente del cromatógrafo de gases. Los
detectores mas usados pertenecen a la categoría de ionización. El principio aplicado
consiste en la medida de los cambios de conductividad eléctrica causados por cambios
en las corrientes de iones generados en la llama del detector.
El FID es el detector mas utilizado, y por lo general el más aplicable, ya que cumple con
todos los requerimientos de un buen detector para cromatografía gaseosa: alta
sensibilidad, muy buena estabilidad, respuesta rápida (1 msec), bajo volumen muerto
(1 mL) y amplia respuesta lineal
Presenta un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrógeno y con aire para
luego encenderse eléctricamente.
La mayoría de los compuestos orgánicos al pirolizarse a la temperatura de una llama de
hidrógeno/aire producen iones que conducen la electricidad a través de una llama
Durante la ionización de los compuestos orgánicos se observa que: el número de iones que
se produce es aproximadamente igual al número de átomos de carbono transformados en
la llama
Características generales del detector de ionización de llama (FID)
muy sensible, cantidad mínima detectable 10-11g (aprox. 50 ppb)
aplicable solamente al análisis de compuestos orgánicos
destructivo
muy buena linealidad
muy buena estabilidad (poco afectada por cambios de flujo o temperatura)
límite de temperatura 400 ºC
gas carrier H2, He, N2 (los gases deben ser de alta pureza)
Insensible a gases no combustibles como agua, dióxido de carbono, dióxido de azúfre,
entre otros
Bajo ruído, resistente y fácil de utilizar
*fuente radiactiva de Ni
*Gas carrier:Argon:metano
GC-MS
De los diferentes acoplamientos desarrollados en relación al estudio de mezclas volátiles, el
acoplamiento GC-MS es el que ha recibido mayor atención desde su inicio.
Entre las técnicas de acoplamiento de GC-MS, la más utilizada es la de análisis por impacto
electrónico (EI). Sin embargo, la técnica de ionización química (CI) tiene cada vez más
aplicaciones, desde su introducción en 1966, por la mayor información que permite obtener,
siendo particularmente útil para la identificación de ésteres, acetales y cetales. Se puede
aplicar ionización química positiva o negativa (gas reactivo: metano, isobutano, amoníaco,
NO2 + metano) .
En la figura se muestra un detector de masa cuadrupolar, el proceso esquemático de
fragmentación que ocurre por impacto electrónico y algunos resultados que ejemplifican la
capacidad del sistema en la identificación de componentes en una mezcla.
OH
Características de las muestras que pueden ser analizadas por cromatografía gaseosa
gases, líquidos o sólidos
peso molecular entre 2 a aprox. 400 unidades de masa. Valores mayores se alcanzan con
técnicas especiales
compuestos orgánicos o inorgánicos
la muestra debe ser volátil o debe poder ser transformada en volátil
ventajas de la cromatografía gaseosa
eficiente, permite alta resolución
requiere muestras pequeñas (microlitros)
alta sensibilidad, detecta ppm y a menudo ppb
cuantitativa (en ciertas condiciones)
alta velocidad de análisis
buena exactitud
fácil de usar, bien conocida
limitaciones de la cromatografía gaseosa
la muestra debe ser volátil
no aplicable a muestras termolábiles
muestras “sucias” requieren de un clean-up previo
se debe utilizar otro sistema de detección (ej. MS) para la confirmación de las identificaciones
es necesario algo de entrenamiento y experiencia
*Pesticidas en general, por ejem.: organohaluros, organofosforados,
que contienen nitrógeno/fósforo
*Herbicidas en general, herbicidas con fenoxiácidos, con triazina
*Hidrocarburos en general, ejem: metil-terbutil-éter
*Fertilizantes, abonos
*Insecticidas, repelentes de insectos
Obs.: En el aire, en el agua, en control de calidad de los productos comerciales,
En muestras biológicas, sangre, orina, etc
*Análisis de medicamentos, drogas de abuso.
*Gasolina común, combustible diesel, gas de cocina, solventes orgánicos
Alcoholes: ejem., metanol, etanol, aldehídos, esteres, en
bebidas, como control de calidad, impurezas, en muestras
biológicas.
Perfumes, fragancias alergénicas, cosméticos, aceites esenciales: petit grain, de
menta, aromatizantes en fármacos, alimentos, bebidas gaseosas, desinfectantes.
Azúcares, ácidos grasos libres, ácidos orgánicos, ésteres metílicos de
ácidos grasos poliinsaturados, esteres metílicos de ácidos grasos bac-
terianos. En muestras biológicas, como metabolitos del organismo humano,
así como también en productos industriales o alimenticios(aceites de coco,
mani, productos de la industría del azúcar)
