ACCIÓN DEL FORMOL Y
DESCALCIFICADOR SOBRE
EL TEJIDO
FORMOL
Es un compuesto químico orgánico de
fórmula química CH2O. Es un gas
incoloro e inflamable a temperatura
ambiente, con un olor penetrante
característico. Se utiliza ampliamente
en la preservación de tejidos
biológicos en la medicina y en la
investigación científica. En forma de
solución acuosa al 37-40%, el formol
se conoce como formaldehido.
REACCIÓN QUÍMICA DEL
FORMOL SOBRE LOS TEJIDOS
El formaldehido reacciona con grupos
amino primarios y otros grupos de las
cadenas de aminoácidos (sulfhídricos,
guanidilos, hidroxilos alifáticos, etc)
de proteínas para formar enlaces
cruzados estables entre ellos. Este
proceso es conocido como
reticulación, en pocas palabras,
permite que las estructuras celulares
se conserven para su posterior
procesamiento y estudio histológico.
RETICULACIÓN
La reacción química entre el
formaldehído y las proteínas ocurre
cuando los grupos aminos primarios de
los aminoácidos presentes en las
proteínas reaccionan con el formaldehído
para formar hidroximetilenos. Los
hidroximetilenos pueden reaccionar con
otros grupos amino primarios, aminas,
anillos aromáticos o grupos guanidina
presentes en las proteínas. Estas
reacciones dan lugar a la formación de
enlaces cruzados entre las proteínas,
conocidos como reticulación.
TIEMPO DE FIJACIÓN
No hay lineamientos claros en relación con el tiempo, se
recomienda individualizar dependiendo del tejido. Se
considera que una óptima fijación requiere un minino de 6
a 8 horas y un máximo de 72 horas, se debe tener especial
cuidado con la sobre fijación
(Ammerlaan et al., 2018).
SOBRE FIJACIÓN
En una fijación excesiva, lo que significa que los
tejidos pueden endurecerse y volverse quebradizos.
Además, la sobre fijación puede llevar a la pérdida
antigénica, a una disminución de la eficacia de los
procedimientos de tinción y de las técnicas de
análisis.
En relación al tiempo de Fijación, en la mayoría de las guías y protocolos de
laboratorio se ha establecido un tiempo de fijación en un rango de 6 a 48 horas
(Tresserra et al., 2016; Engel & Moore, 2011).
Se ha demostrado que tiempos cortos de fijación alteran la reacción antígeno
anticuerpo debido a que, en la fase de deshidratación del proceso, se genera una
fijación alcohólica por un mecanismo de coagulación (Tresserra et al., 2016; Werner
et al., 2000).
Tiempos prolongados de fijación generan perdida de los puntos antigénicos debido a
las características químicas del fijador (Tresserra et al., 2016; Engel & Moore, 2011).
Estos puntos antigénicos disminuyen a los 8 días y se pierden en su totalidad a los 16
días de fijación (Tresserra et al., 2016)
FORMOL TAMPONADO
Es la solución más empleada hoy en día para prevenir el choque
osmótico que provoca la disolución de formol en agua destilada. Se
prepara de la siguiente manera, como amortiguador se emplea el tapón
fosfato calibrado con pH de 7.0 a 7.2 de la siguiente fórmula:
Formol…………………………………..100.0 ml.
FOSFATO SÓDICO MONOBÁSICO…………………….4.0 gr.
FOSFATO SÓDICO DIBÁSICO ……………………………6.5 gr.
AGUA DESTILADA………………………………...….900ml.
DESCALCIFICADOR
La descalcificación describe la técnica para eliminar los minerales del
hueso u otro tejido calcificado para poder preparar cortes de parafina de
buena calidad que preserven todos los elementos microscópicos
esenciales. La descalcificación se lleva a cabo después de que la
muestra se haya fijado concienzudamente y antes del procesamiento
rutinario en parafina.
HIDROXIAPATITA
El principal mineral duro de los tejidos animales es la hidroxiapatita,
mineral de fosfato cálcico, [Ca10(PO4)6(OH)2], que se encuentra en
los huesos distribuido entre las fibras de colágeno. Estos minerales se
encuentran en equilibrio con su solución saturada según las siguiente
reacción:
Ca10(PO4)6(OH)2 = 10Ca2+ + 6PO43- + 2OH-
Si eliminamos alguno de los componentes a la derecha de la reacción,
el mineral (a la izquierda) se disolverá para equilibrar de nuevo la
solución. Este es el principio de los descalcificantes.
Existen tres tipos principales de agentes
descalcificadores:
Los basados en ácidos minerales fuertes
Los basados en ácidos orgánicos más débiles
Los compuestos por agentes quelantes.
ÁCIDOS FUERTES
Los ácidos fuertes como el ácido clorhídrico o el
ácido nítrico en concentraciones de hasta el 10 %
son los más rápidos en acción, pero si se utilizan
durante un tiempo excesivo, provocan rápidamente
una pérdida de tinción nuclear y pueden macerar los
tejidos. Es importante utilizar una prueba de punto
final adecuada para minimizar la exposición de las
muestras a estos agentes.
PRUEBA DE PUNTO FINAL
La prueba de punto final es una técnica utilizada en histología
para determinar si un tejido ha sido completamente
descalcificado.
En la prueba de punto final, se sumerge un trozo de tejido en
un descalsificador y se retira periódicamente para examinarlo
bajo el microscopio. El tejido se tiñe con un colorante
específico que cambia de color en presencia de iones de calcio.
Cuando el colorante deja de cambiar de color, se considera que
se ha alcanzado el punto final del proceso de descalsificación.
Descalcificadores de ácidos minerales
Descalcificador Fórmula Comentario
Ácido nítrico 5 % en agua destilada De acción rápida; si se
supera el punto final,
la tinción se verá
afectada.
Ácido clorhídrico 5-10 % en agua Debe retirarse toda
destilada muestra del formol
antes de colocarse en
HCl para evitar la
formación de éter bis
(clorometílico) (un
carcinógeno). De
acción rápida; si se
supera el punto final,
la tinción se verá
afectada.
ÁCIDOS DÉBILES
Los ácidos débiles, como el ácido fórmico, son
populares y son ampliamente utilizados para la
descalcificación. El ácido fórmico puede usarse como
una solución acuosa simple al 10 % o combinado con
formol o con un tampón. Aunque es más lento que los
agentes ácidos fuertes, actúa con mucho más cuidado y
es menos probable que interfiera con la tinción nuclear.
Descalcificadores ácidos débiles
Descalcificador Fórmula Comentario
Ácido fórmico 10 % en agua Un simple
destilada descalcificador
eficaz.
AGENTES QUELANTES
Los agentes quelantes como el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) actúan capturando los
iones de calcio de la superficie del cristal de apatita,
reduciendo lentamente su tamaño. Debido a que el proceso es
muy lento pero muy suave (pueden ser necesarias semanas
dependiendo del tamaño de la muestra), este reactivo no es
adecuado para muestras urgentes, sino más bien para
aplicaciones de investigación en las que se requiere una
morfología de muy alta calidad o se deben conservar
elementos moleculares particulares para técnicas como IHC,
FISH (hibridación fluorescente in situ) o PCR.
Descalcificador Fórmula Comentario
EDTA neutra Sal disódica de EDTA Actúa lentamente, pero
250 g causa poco daño tisular.
Agua destilada 1750 ml Las tinciones
Llevar a un pH de 7,0 convencionales no se
añadiendo hidróxido de ven afectadas en gran
sodio (se necesitarán medida.
unos 25 g).
