RECONSTRUCCIÓN
: SOLUBILIZACIÓN
CON
DETERGENTES,
FUERZA IÓNICA Y
AGENTES
CAOTRÓPICOS
IIA. ROXANA GUADALUPE HERNANDEZ GUARNEROS
KARINA NAVA ESPINOZA
SOLUBILIDAD
Cuando se purifican las
proteínas para estudios
funcionales o estructurales, o
para procesamiento preparativo
y producción, el primer paso es
romper las células o el tejido
para tener acceso a las
proteínas específicas. La lisis
celular y la solubilización de
proteínas son fundamentales
para un análisis eficaz y un
procesamiento eficiente. El
método de extracción puede ser
enzimático, químico, mecánico
o una combinación.
¿QUE SON LOS DETERGENTES
Los detergentes son anfifilos solubles que
poseen la capacidad de solubilizar grasas,
dando lugar a micelas mixtas lípido-
detergente, que son solubles en agua. Los
detergentes son ampliamente utilizados en las
industrias alimentaria y de bebidas, textil,
médica y farmacéutica, entre otras. En
biología molecular, los detergentes son
herramientas insustituibles en la solubilización
de las membranas celulares y la posterior
purificación de proteínas de membrana.
TIPOS DE DETERGENTES
IONICOS
Tienen carga
Desnaturalizan por completo la proteínas
Interrumpen enlaces iónicos y enlaces de
hidrógeno
NO-IONICOS
No desnaturalizan proteínas
Aislamiento de proteínas
No tienen carga
La geometría molecular del lípido o del
detergente determina el modo de
ensamblaje: moléculas lipídicas
aproximadamente cilíndricas dan origen en
agua a bicapas planas, mientras que un
detergente cónico origina micelas altamente
curvadas. En ambos casos los contactos
cadena hidrocarbonada-agua se minimizan.
Solubilización y reconstitución de
membranas por adición y eliminación de
detergentes. Cuando las bicapas planas (que
pueden incluir proteínas) interaccionan con
micelas de detergente curvas, se forman
micelas mixtas lípido – proteína –
detergente en el proceso llamado
solubilización.
Las tres etapas de
solubilización de la bicapa
por los detergentes (11).
(Arriba) Representación
esquemática de las etapas I –
III. (Rojo) Grupos polares de
fosfolípidos. (Azul) Grupos
polares de detergente.
(Abajo) La solubilización de
una preparación de vesículas
(vesículas unilamelares
pequeñas o grandes) se
siguió a través de los
cambios en la turbidez
RESISTENCIA A LOS
DETERGENTES Y BALSAS DE
MEMBRANA
Algunos componentes de membrana no se
solubilizan incluso a altas concentraciones
de determinados detergentes . En
particular, se sabe desde hace mucho
tiempo que hay proteínas de membrana que
están ancladas a la bicapa lipídica por
glicosilfosfatidilinositol (GPI), y que son
resistentes a la solubilización por
detergentes como el Triton X-100 . Brown This Photo by Unknown author is licensed under CC BY-NC-ND.
y Rose introdujeron la idea de
microdominios de la bicapa lipídica que
serían insolubles, y en los cuales se
anclarían las moléculas de GPI insertado.
Altas
concentraciones de
CMC
(Concentración
Micelar Crítica) se
forman micelios
Bajas
concentraciones se
disuelve pero no
forma micelios
AGENTES CAOTRÓPICOS
Desorganiza la estructura dimensional.
Desnaturalización de proteínas,
Usa para extracción y aislamiento de ácidos nucleicos.
Urea, Tiourea, Cloruro de Guanidinio
Staphylococcus aureus alfa-hemolisina es una proteína tóxica involucrada en
enfermedades humanas
Paso incontrolable de moléculas por el poro causa la muerte celular
Desnaturalización por urea del canal de alfa-hemolisina (más resistente) y la formación
monómero alfa-hemolisina incubado con urea antes de la inserción a la bicapa lipídica
El incremento de urea lleva a la disminusión del canal
Se pierde la asimetría
El paso de moléculas por el poro alfa-hemolisina puede ser reducido
Pastoriza-Gallego, M., Oukhaled, G., Mathé, J., Thiebot, B., Betton, J.-M., Auvray, L., & Pelta, J. (2007). Urea denaturation of α-hemolysin pore inserted in planar lipid bilayer detected by single nanopore
recording: Loss of structural asymmetry. FEBS Letters, 581(18), 3371–3376.
DETERGENTES: DE LOS PRINCIPIOS FÍSICOS A LAS APLICACIONES BIOFARMACÉUTICAS (O POR QUÉ
PREVENIMOS LA COVID-19 CON AGUA Y JABÓN
DETERGENTS: FROM PHYSICAL PRINCIPLES TO BIOPHARMACEUTICAL APPLICATIONS (OR WHY WE
FIGHT COVID-19 WITH TOILET SOAP)
Usando suficiente detergente y fosfolípido, se pueden hacer micelas mixtas para que
contengan una sola molécula de proteína de membrana o ninguna. En estas condiciones, se
pueden usar métodos estándar para purificar proteínas de membrana, cristalizarlas o
reconstituirlas en proteoliposomas.
Una introducción sobre los detergentes y las membranas va seguida por una descripción
cuantitativa detallada del mecanismo de solubilización de la membrana por los detergentes, y
por una discusión crítica del concepto de membranas resistentes a los detergentes en relación
con la hipótesis de las balsas lipídicas (rafts). A continuación, se incluye una sección
experimental que resume los principales resultados del grupo de los autores. Finalmente, se
describen algunas aplicaciones biofarmacéuticas. Como ejemplo práctico, se discute el uso de
jabón de tocador en la prevención de la COVID-19.
Salvi, G., De Los Rios, P., & Vendruscolo, M.
(2005). Effective interactions between chaotropic agents and
proteins. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics,
61(3),
Alberts, B., et al. (2015). Molecular Biology of the
Cell, 5th ed., Garland Pub., 583-584
REFERENCIAS
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Nelson, D. , et al. Lehninger Prnciples of Bioquímica, 5th.,
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