• UNIDAD 9.

ANÁLISIS MOLECULAR DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA

• Mecanismos implicados en la variabilidad genética:
Recombinación homóloga y no homóloga, mutación, duplicación a
gran y pequeña escala, transposición y retrotransposición.
Consecuencias funcionales de los polimorfismos.

• Métodos empleados para estudios de polimorfismos genéticos en

el campo de la Medicina. Marcadores moleculares: Polimorfismos
en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), Polimorfismos
en la longitud de secuencias simples (SSLP), Polimorfismos de un
solo nucleótido (SNP), Polimorfismo conformacional de cadena
sencilla del DNA (SSCP), Minisatélites (Variable Number Tandem
Repeats o VNTR), y Microsatélites STR (Short Tandem Repeats).
• SEMINARIO 3: Huella dactilar del ADN (Fingerprint). Concepto y
fundamentación. Aplicación médica.
Organización del genoma
30.000
ON

OFF
VARIABILIDAD
 VARIACIONES GENÉTICAS
La variación de naturaleza cuantitativa y de
origen genético dentro de las poblaciones se
presenta en dos formas básicas:
• Mutantes raros
• Polimorfismo genético
 POLIMORFISMO

Todo polimorfismo es el
reflejo del genotipo de los
individuos “constitución
alélica para un locus
determinado o para un
conjunto de ellos “
POLIMORFISMO
 Mayor
proporción de
individuos
heterocigotos

Mayor número Mayor grado de

de alelos polimorfismo
 MUTACIONES:
causa de los polimorfismos
 MUTACIÓN vs POLIMORFISMO
MUTACIÓN POLIMORFISMO
Ocurre si la variante más Ocurre si la variante tiene una
escasa aparece con una frecuencia mayor del 1% en la
frecuencia menor del 1% en la población.
población.
Generalmente se asocian con Cuando la presencia de la
patologías variación genética es común
en la población, y por tanto
estable y nada o poco
perjudicial.

(Clarke, 1975).
EJEMPLOS HIPOTÉTICOS DE LA FRECUENCIA DE
ALELOS EN 5 LOCUS DE UNA POBLACIÓN
ALELO LOCUS A LOCUS B LOCUS C LOCUS D LOCUS E

1 99,5% 98% 99,5% 93,5% 95,7%

NORMAL POLIMORFICO NORMAL POLIMORFICO POLIMORFIC
O
2 0,5% 2% 0,3% 5% 4%
MUTADO POLIMORFICO MUTADO POLIMORFICO POLIMORFIC
O
3 0,2% 1,5% 0,3%
MUTADO POLIMÓRFICO MUTADO
100% 100% 100% 100% 100%
DIVERSIDAD GENÉTICA DENTRO DE
UNA ESPECIE
MECANISMOS IMPLICADOS EN LA
VARIABILIDAD GENÉTICA
 CAUSA DE LAS DUPLICACIONES
RECOMBINACIÓN NO HOMÓLOGA O DESIGUAL
 FAMILIAS MULTIGÉNICAS
genes que codifican polipéptidos con secuencias
relacionadas
FAMILIA GÉNICA
GLOBINAS Proteínas de transporte y almacén de
oxígeno en sangre y músculo
ACTINAS Parte del aparato contráctil en células
musculares y del citoesqueleto en células
no musculares
OPSINAS Proteínas que detactan la luz a diferentes
longitudes de onda en células de la retina
COLÁGENO En diferentes tipos de tejido conjuntivo
ALBÚMINAS E INMUNOGLOBULINAS En plasma sanguíneo
FAMILIA GÉNICA
GENES QUE CODIFICAN EN TEJIDOS
DIFERENTES
ISOFORMAS Formas alternativas de una proteína
ISOENZIMAS O ISOZIMAS Formas alternativas de una enzima
- Por ej: FOSFATASA ALCALINA Codificada por al menos 4 genes
diferentes que se expresan de forma
diferencial en cada tejido. Debido a una
duplicación génica ancestral.
2q ALPI Intestino Con un 87% de similitud
2q ALPP Placenta entre sí
2q ALPPL Placenta Similar a la de Placenta
1p ALPL Higado, hueso, riñon, otros Similitud de secuencia de 57% con ALPI y
55% con ALPP
 TRANSPOSICIÓN
• Desplazamiento de un sitio a otro del
cromosoma de fragmentos de DNA( cientos a
decenas de miles) llamados elementos
móviles, elementos transponibles o
transposones.
• Son responsables de la gran proporción de
secuencias SINE tipo Alu y LINE-1 , que por sí
solas suponen el 10% del genoma.
MECANISMOS DE TRANSPOSICIÓN

La transposición es efectuada por

recombinación replicadora. El transposón
no abandona su sitio durante el curso de la
transposición, sino que como consecuencia
de todos los eventos de transposición se
puede detectar una copia del transposón
en el sitio original y una copia en el nuevo
sitio. La transposición es acompañada por
aumento en el número de copias del
transposón. La transposición incluye
entonces dos conjuntos de reacciones, que
pueden en principio ocurrir en cualquier
orden; la primera reacción es la replicación
del transposón, sin replicación de
secuencias cromosómicas adyacentes, y la
segunda incluye el rompimiento de la
secuencia blanco para generar un sitio de
inserción del transposón.
CONSECUENCIAS FUNCIONALES DE
LOS POLIMORFISMOS
• POLIMORFISMO EN REGIONES CODIFICANTES
O POLIMORFISMOS GÉNICOS
• La alteración puede modificar las características bioquímicas,
fisiológicas o morfológicas de la célula, pudiendo llegar a
originar efectos patológicos, en función de la gravedad de
dicho efecto fenotípico. Se puede distinguir entre:
– Variaciones fenotípicas que no influyen en la
susceptibilidad a enfermedades (pol: estatura, color
cabello, grupo sanguíneo)
– Variaciones fenotípicas que influyen levemente en la
susceptibilidad a ciertos procesos patológicos
– Variaciones fenotípicas que desempeñan un papel
importante en la aparición de una enfermedad genética.
 CONSECUENCIAS FUNCIONALES DE
LOS POLIMORFISMOS
• POLIMORFISMO EN REGIONES GÉNICAS NO
CODIFICANTES

Con
efecto

Sin
efecto
 CONSECUENCIAS FUNCIONALES DE
LOS POLIMORFISMOS
• POLIMORFISMO EN REGIONES NO GÉNICAS,
NO CODIFICANTES. Es el DNA que más difiere
entre individuos
 EJEMPLOS DE POLIMORFISMO
GÉNICO
• GRUPO ABO
• LOCUS DE LA GALACTOSEMIA
• DE LA α1-ANTITRIPSINA

• (Luque y herraez) Tema 26 y 27

GRUPO
ABO
 LOCUS DE
LA
GALACTOSEMIA
9p13 (150 alelos)

GEN GALT
(Galactosa -1-fosfato
uridiltransferasa)

379 aa
43KDa

Uridilato (UMP)
9p13 (150 alelos)
 POLIMORFISMO DE LA ALFA1-
ANTITRIPSINA
• Gen α1-antitripsina
• Locus PI –Inhibidor de proteasas
• 14q32.1
• Codifica para α1-antitripsina, proteína plasmática que
inhibe la actividad de varias proteasas, como tripsina,
quimiotripsina y elastasa.
• Regula la elastasa leucocitaria, para evitar que ella
destruya la elastina y otras proteínas del tejido
conjuntivo pulmonar, produciendo daño en la pared
alveolar.
 DEFICIENCIA DE ALFA1-
ANTITRIPSINA
• Enfisema (Enfermedad pulmonar
neurodegenerativa)
• Enfermedades hepáticas (Cirrosis y cáncer)
 POLIMORFISMO DE LA ALFA1-
ANTITRIPSINA
• Más de 75 alelos
 POLIMORFISMO MITOCONDRIAL
• > % de mutaciones que el nuclear por exposición a especies
reactivas de Oxígeno resultantes del metabolismo oxidativo
mt.
• Desprotegido por carecer de histonas
• Menor eficacia de los sistemas de reparación mt.
• De esas mutaciones aquellas que afectan a regiones
codificantes (> 93% del DNAmt) suelen ser perjudiciales para
la funcionabilidad de las proteínas y para la vida de la célula.
• Bucle D (única región no codificante) : región hipervariable
(estudios familiares, antropológicos, evolutivos y de
identificación)
ANÁLISIS DE GENES. DETECCIÓN
Y APLICACIONES DE LOS
POLIMORFISMOS
 SECUENCIACIÓN
El método dideoxi de secuenciación ideado por
Sanger está basado en el empleo de
didesoxinucleótidos que carecen de uno de los
grupos hidroxilo, de manera que cuando uno de
estos nucleótidos se incorpora a una cadena de ADN
en crecimiento, está cadena no puede continuar
elongándose ya que la ADN polimerasa necesita un
extremo 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y
el dexosinucleótido incorporado carece de este
grupo hidroxilo.
Terminación de cadena de Sanger
• Se aísla y se clona el ADN que se desea secuenciar, este ADN se desnaturaliza y se
emplea una sola hélice en la secuenciación. En la secuenciación se utiliza un
cebador o “primer” marcado radiactivamente que suministra el extremo 3’OH que
necesita la ADN polimerasa. Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con
el ADN molde de hélice sencilla que se desea secuenciar, con ADN polimerasa, con
el cebador marcado y con los cuatro nucleótidos trifosfato. A cada tubo se le
añade una pequeña proporción de un didesoxinucleótido trifosfato , un tubo con
ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto con ddCTP. En cada uno
de estos tubos se producirán cadenas de ADN de distintas longitudes, terminando
todas en el lugar en el que se incorporó el dideoxi correspondiente añadido al
tubo. 
[Link]
 • Posteriormente, estas piezas de ADN se separan mediante electroforesis vertical
en geles de acrilamida y se realiza una autorradiografía. Las piezas más pequeñas
migran más rápidamente que las grandes y la secuencia se puede leer
directamente sobre la autorradiografía del gel de acrilamida.

LA SECUENCIA DEL FRAGMENTO ES: 5’ GAATTGGCGGGCTA 3’

[Link]
A C G T

CTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCT...3’
5’
5' CCTCAAGTCGAGGTTATCAGATCTGCAACTCATAG 3'
[Link]
NUSSBAUM R.L., MCLNNES R.R.
AND WILLARD H.F. THOMPSON &
THOMPSON. Genética en Medicina.
Séptima Edición. 2008. España.
Automatizacion
Escala de
secuencia
mediante
secuenciación
radiactiva
comparada con
máximos de
fluorescencia.
SNP (Polimorfismos de nucleótido simple)

• Son responsables de gran diversidad del genoma

humano
• La mayoría no originan enfermedades, en ocasiones
pueden localizarse cerca de mutaciones o
polimorfismos involucrados en procesos patológicos,
los que los hace útiles como marcadores genéticos.
• Mapa de SNPs.
RFLPS - RESTRICTION FRAGMENT
LENGTH POLYMORPHISM
Pedro J. Rocha. PALMAS - Vol. 24 No. 2, 2003
 RFLPS - RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM

Representación esquemática del principio genético del RFLP

 RFLP
• Polimorfismos RFLP se localizan con una
sonda particular, para examinar un locus
único.
• Permite detectar alelos en un mismo locus
RFLP
POLIMORFISMO EN LA B-GLOBINA
causante de ANEMIA FALCIFORME
ANÁLISIS POR RFLP DE LOS DOS
ALELOS DE UN LOCUS EN UNA
FAMILIA
 Polimorfismos en la longitud de
secuencias simples (SSLP)
• Los SSLPs son arreglos de secuencias repetidas que muestran variaciones
en su longitud, con alelos que difieren en el número de unidades
repetidas, pueden ser multialélicos y cada SSLP puede tener un número
de variantes de longitudes diferentes; existen dos tipos de estos
marcadores que se clasifican como DNA satélite, aunque no aparezcan
con bandas "satélite" en gradiente de densidad:
– Minisatélites, también conocidos como repeticiones en tandem de
número variable (variable number of tandem repeats (VNTRs)), en los
cuales la unidad repetida es de hasta 25pb de longitud.
– Microsatélites o repeticiones simples en tandem (simple tandem
repeats (STRs)), cuyas repeticiones son menores, usualmente de
unidades de dinucleotidos o trinucleotidos.
 MICROSATÉLITES (STR ó SSR) MINISATÉLITES (VNTR)
Difieren en el número y la composición de Difieren en el número y la composición de
nucleótidos. nucleótidos.
2 a 6 pb repetidos en tándem 10 a 100 pares de bases
Altamente variables en tamaño, en un rango En cada locus hipervariable están repetidas
alrededor de los 100-200pb. hasta 50 veces.
Algunos en cada locus se repiten 10-30
copias de una repetición.
Los microsatélites están más Los minisatélites no se encuentran
convenientemente espaciados a través del repartidos por todo el genoma,
genoma. Son los marcadores moleculares encontrándose fundamentalmente en las
más polimórficos que se conocen. regiones teloméricas
Los microsatélites típicos constan de 10-30 La mayoría de los alelos de minisatélites
copias de una repetición que usualmente no tienen tallas superiores debido a que sus
son superiores a 4pb de longitud, por lo unidades de repetición son relativamente
tanto son mucho más fáciles de analizar por grandes y con una sola copia, por lo que se
PCR. requerirían productos de PCR de varias kb
Porque la vía más rápida de tipificar el para tipificarlos.
polimorfismo de longitud es por PCR, pero
esta técnica es mucho más exacta cuando se
amplifican secuencias de longitud menor a
300pb.
 75-100 % de los carcinomas colorrectales en pacientes
con CCHNP tienen inestabilidad de microsatélites.

MICROSATÉLITE NORMAL

A C A C A C A C A C A C (AC)
6

MICROSATÉLITES DE CÉLULAS TUMORALES ALTERADOS EN

LONGITUD
A C A C A C A C A C A C A C A C (AC)8

A C A C (AC)2

A C A C A C A C A C A C A C A C A C A C (AC)10
 Polimorfismos en el número de repeticiones en tandem
Microsatélites (STRs)

Weber y May (1989) propusieron la PCR como método general para el estudio del
polimorfismo de estas regiones, las que se amplifican individualmente utilizando
un par de oligonucleótidos específicos (20-30) complementarios a las secuencias
únicas que flanquean el microsatélite. Los fragmentos amplificados, casi
invariablemente, presentan un polimorfismo extensivo resultante de la diferencia
en el número de elementos simples repetidos. Así, cada región microsatélite,
independientemente de la secuencia repetida, constituye un locus altamente
variable, multialélico y de gran contenido informativo.
Secuencias utilizadas en la huella
digital de ADN MINISATÉLITES
Secuencias repetidas en tándem
un número variable de veces.

Secuencias cortas (entre 10 y

100 pb) que pueden estar
repetidas 5 veces en un lugar
del cromosoma (locus) y estar
repetida 4 veces en otro locus
distinto y 7 veces en otra
posición.

El número de veces que está

repetida varía de un lugar a
otro del mismo cromosoma.
Secuencias repetidas en tándem, utilizadas en la huella digital de
ADN MINISATÉRLITES (VNTRs)

El número de veces que

la secuencia está
repetida varía entre
cromosomas distintos.

También varía de unos

individuos a otros.
• Cada segmento amplificado representa un alelo diferente del mismo
locus.
• Polimorfismos VNTR se localizan con una sonda particular, para examinar
alelos en un locus único.
• La detección de estas secuencias se ha realizado en geles de
poliacrilamida altamente resolutivos debido a que las diferencias entre
uno y otro alelo pueden ser de uno o dos nucleótidos y más
recientemente en secuenciadores automáticos utilizando fluoróforos
diferentes para cada minisatélite (Womack, 1993)
 HUELLA DACTILAR DEL DNA
• Aunque se detectan con una sonda particular, polimorfismos VNTR en
un locus único, se debe tener en cuenta que la mayoría de secuencias
repetitivas que se estudian en los polimorfismos VNTR o minisatélites
aparecen en múltiples zonas del genoma (moderadamente repetitivos y
dispersos, organizado en bloques dispersos de repeticiones en tandem).
• Las unidades de repetición presentes en puntos distintos del genoma
pueden ser idénticas o bien lo suficientemente similares como para
permitir su detección simultánea en todos esos loci.
• Así, si se utiliza como sonda una secuencia que pueda hibridar con
todos los loci de una familia de DNA (mini o microsatélite), se puede
observar simultáneamente el patrón polimórfico de todos ellos que,
dada la combinación de gran número de variaciones individuales, es
prácticamente único para cada individuo.
Polimorfismo en el número de repeticiones en tandem
VNTR (Variable Number Tandem Repeats)
Minisatélites
Tomado de “. Ensayos médicos sobre genética”, 2006. Pag. 46.
• Además, pueden analizarse muchos genotipos simultáneamente por ser
los marcadores más adecuados para el desarrollo de mapas de ligamiento.
Estos se han utilizado
cada vez menos, debido a
causas como la gran
complejidad de la técnica y
su elevado costo
 DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE
[Link]

• Afecta a 1/3.500 niños del sexo masculino.

• Debilidad y adelgazamiento muscular progresivos en
la infancia.
• Es una enfermedad recesiva ligada al X.

 Guillaume Benjamin
Amand Duchenne
(De Claudia T. Silva, Dora Fonseca, Carlos Martín Restrepo, Nora C. Contreras, Heidi E. Mateus. Corporación editora médica del Valle 2004, Colombia médica, Deleciones en el gen de la
distrofina en 62 familias colombianas: correlación genotipo-fenotipo para la distrofia muscular de Duchenne y Becker. )
 [Link]

• Distrofina
• Xp21 (2.300 Kb y 79 exones)
• 14 Kb RNAm -> 3.685 a.a
(De Dora Fonseca, Claudia Tamar Silva, Heidi Mateus. Corporación editora médica del Valle 2008, Colombia médica, Detección de portadoras de distrofia muscular de Duchenne
en familias colombianas mediante análisis de microsatélites.)
 Caso clínico

Sistema Alelos Sistema Alelos

5’ DYSII (DXS1242). Extragénico 214-228 STR-49 (DXS1236). Intragénico 227-241
STR- 2. Intragénico 96-116 STR-50 (DXS1235). Intragénico 233-251
STR-7 (DXS205). Intragénico 227-241 STR-51 (DXS1036). Intragénico 145-151
STR-44 (DXS1219). Intragénico 174-204 STR-63 (DXS1214). Intragénico 210-220
STR-45 (DXS1237). Intragénico 156-184 STR-79 (DXS992). Extragénico 201-211
(De Dora Fonseca, Claudia Tamar Silva, Heidi Mateus. Corporación editora médica del Valle 2008, Colombia médica, Detección de portadoras de distrofia muscular de Duchenne
en familias colombianas mediante análisis de microsatélites.)
(De Dora Fonseca, Claudia Tamar Silva, Heidi Mateus. Corporación editora médica del Valle 2008, Colombia médica, Detección de portadoras de distrofia muscular de Duchenne
en familias colombianas mediante análisis de microsatélites.)
 Polimorfismo conformacional de
cadena sencilla del DNA (SSCP)
• El ADN de cadena simple tiende a doblarse y
formar estructuras complejas estabilizadas por
enlaces intramoleculares débiles,
especialmente por puentes de H.
• La movilidad electroforética de dichas
estructuras sobre geles no desnaturalizantes
dependerá no solo de la longitud de las
cadenas, sino también de su conformación, la
cual esta determinada por la secuencia de ADN.
• Consiste en la detección de las diferencias en la
estructura secundaria o terciaria entre fragmentos
de ADN amplificados, con distinta secuencia (Orita
et al., 1989).
• Esto permite la detección de mutaciones puntuales
de ADN sin necesidad de conocer su secuencia
(Berta et al., 1990) y son capaces de identificar entre
el 30 y 70% de todos los polimorfismos debidos a
una mutación simple (Larsen y Nielsen, 1992).
• Su detección se lleva a cabo en un gel de
acrilamida en condiciones no
desnaturalizantes.
• Los primer pueden estar radiaoctivamente
marcados, o puede realizarse la detección de
los productos amplificados por tinción con
plata y siempre deben incluirse muestras
controles para identificar el tipo salvaje del
mutado .
 MONITOREO DE UNA MUTACIÓN EXON 3 DEL GEN
CFTR POR ANÁLISIS DE SSCP

El gen se amplificó Se incluyeron 4

por PCR partiendo de muestras controles
ADN genómico de 9 que contenían la
individuos no mutación en dicho
relacionados entre sí exón

El ADN de conformación simple migra más lentamente en el mismo gel (panel

superior).
SSCP es simple y adecuadamente sensible para fragmentos de hasta 200pb de
longitud

[Link]
ANALISIS DE POLIMORFISMOS CON
FINES DIAGNÓSTICOS
MICROARRAYS O BIOCHIPS
 MICROMATRICES DE ADN
• Desde mediados de los años noventa existe una potente técnica de
análisis genómico de expresión como son las micromatrices de ADN que
bien pueden ser diseñadas con ADN codificante (ADNc) (ADN
monocatenario y complementario al ARN mensajero que contiene la
secuencia codificante de un gen) o bien con secuencias cortas de
nucleótidos (oligonucleótidos), que permiten el análisis de la expresión de
miles de genes simultáneamente (De Risi, 1996; Gerhold, 1999). Las
micromatrices, también conocidas como microarrays o biochips consisten
en soportes físicos (como un portaobjetos de cristal) en los cuales se
imprimen de forma organizada los fragmentos de ADN correspondientes a
miles de genes. Cada punto en la matriz corresponde con un gen
específico y definido.

Tomado de © Elena María Ruiz Ballesteros, 2009

Tomado de © Elena María Ruiz Ballesteros, 2009
FIN