UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL POLITÉCNICA

"ANTONIO JOSÉ DE SUCRE"

VICERRECTORADO BARQUISIMETO
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
ANALISIS INSTRUMENTAL

UNIDAD V: TÉCNICAS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICAS

 TEMA 12.- INTRODUCCION A LAS
SEPARACIONES CROMATOGRAFICAS
La cromatografía es un potente método de separación que
tiene aplicación en muchas ramas de la ciencia.
La técnica fue inventada y denominada así por el botánico
ruso Mikhail Tswett (1872-1919) a principios del siglo XX.

El nombre que se eligió para el

método viene del griego
chroma que significa “color”,
y graphein que significa
“escribir”). 1910
 PREMIO NOBEL

Richard L. Synge (Bioquímico Británico) y Archer Martin

(Bioquímico Británico), en 1952 recibieron el Premio
Nobel de Química, por la invención de la cromatografía
de partición o de reparto sobre papel.

Trabajaron sobre el modo de separar mezclas

complejas de aminoácidos de proteínas de la materia
viva, en sus componentes individuales
 DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía agrupa un conjunto
importante y diverso de métodos que facilitan
la separación, identificación y determinación
de componentes estrechamente relacionados
en mezclas complejas

En general: En todas las separaciones

cromatográficas la muestra se disuelve con
una fase móvil —que puede ser un gas, un
líquido o un fluido supercrítico— la cual se
hace pasar a través de una fase estacionaria
inmiscible fija en una columna o en una
superficie sólida.
Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra
se distribuyen en grados distintos entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por
la fase estacionaria se mueven con mucha lentitud con el flujo de la
fase móvil. En cambio, los componentes unidos débilmente a la fase
estacionaria se mueven con rapidez.

Como consecuencia de las distintas velocidades de migración, los

componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas

FASE MÓVIL

MUESTRA
CLASIFICACION DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
 Los métodos cromatográfícos se pueden clasificar en dos
maneras:

1.- Según los medios físicos por medio de los cuales la fase
móvil y la fase estacionaria se pongan en contacto

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

CROMATOGRAFIA EN PLANO
CLASIFICACION DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
2.- Según los tipos de fase móvil y fase estacionaria, y en la clase de
equilibrios involucrados en la transferencia de los solutos entre las
fases
CROMATOGRÁFIA DE ELUCIÓN EN COLUMNA

ELUCIÓN: La elución implica la purificación de una especie por lavado

en una columna mediante la adición continua de fase móvil nueva. En

la cromatografía moderna, la adición continua se consigue por medio

de una bomba en CL y en CFS o por la aplicación de presión en CG.

a) Diagrama que muestra la
separación de una mezcla de
componentes A y B por
cromatografía de elución en
columna.

b) Señal de salida del detector en

las distintas etapas de la elución
que se muestran en a)
 CROMATOGRAMA
Si al final de la columna se coloca un detector que responde a la concentración del
soluto y se registra su señal en función del tiempo, o del volumen de fase móvil
añadido, se obtiene una serie de picos como se muestra en la Figura. Este gráfico se

denomina cromatograma, es útil tanto para los análisis cualitativo como

cuantitativo. La posición de los picos en el eje del tiempo puede servir para
identificar los componentes de la muestra; las áreas bajo los picos proporcionan
una medida cuantitativa de la cantidad de cada componente.
Cromatograma de un licor
Cromatograma de una muestra de gasolina
Cromatograma de una muestra de Gas Licuado de Petroleo
Cromatografía de Intercambio Iónico de una muestra de aminoácidos
Cromatograma de una muestra de agua de pozo por Cromatografía Iónica
TEORIA RELACIONADA A LA CROMATOGRAFÍA

La cromatografía es un sistema de separación dinámica, porque

continuamente se producen equilibrios entre los componentes de la
mezcla a separar y las fases móvil y estacionaria, Es decir, se establece un
equilibrio entre la concentración del componente presente en la fase móvil
y la concentración presente en la fase estacionaria.
 FASE MÓVIL. FASE ESTACIONARIA.
CARACTERÍSTICAS. CARACTERÍSTICAS.

 La fase estacionaria consiste en

 La fase móvil puede ser un líquido o un 
partículas, generalmente sólidas,
gas, y su función es transportar a los
pequeñas y con una superficie
componentes de la mezcla a través del
microporosa, de forma que presenta un
sistema cromatográfico.
amplio desarrollo superficial.
  El estado físico de la fase móvil
determina la primera gran división de los
  Puede estar empaquetada en forma de

métodos cromatográficos. columna o extendida en forma de capa.

 Es un fluido que penetra a través o a lo

 El espesor de la película de la fase

largo del lecho estacionario, en una estacionaria liquida influye en la

dirección determinada. retención y en la capacidad de la

columna.
 VELOCIDADES DE MIGRACIÓN DE LOS SOLUTOS

La eficacia de una columna

cromatografía para separar dos
solutos depende en parte de las
velocidades relativas con las que se
lavan o se purifican las dos
especies. Esas velocidades están
determinadas por la magnitud de
las constantes de equilibrio para las
reacciones mediante las cuales los
solutos se distribuyen
entre las fases estacionaria y
móvil.
 CONSTANTE DE DISTRIBUCIÓN
Los equilibrios de distribución en la cromatografía se expresan mediante ecuaciones
sencillas que suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y
móvil.

Entonces, para una especie A del soluto se puede escribir:

Kc para la distribución de la especie A entre las dos fases se designa como constante
de distribución y se define como:

:Es la actividad del soluto A en la fase estacionaria.

:Es su actividad en la fase móvil.
 o Cuando las concentraciones son bajas o cuando intervienen
especies no aniónicas, los coeficientes de actividad se acercan a la
unidad.

En estas condiciones, se sustituyen las actividades cS , por la concentración

analítica molar del soluto en la fase estacionaria y por analítica molar en la
fase móvil. Entonces, es posible escribir la ecuación:

Donde: y son las cantidades de moles de analito en las dos fases y y son los
volúmenes de las dos fases.
La cromatografía en la que se aplica la ecuación se denomina
cromatografía lineal.
Da como resultado características tales como picos simétricos tipo Gauss
y tiempos de retención independientes de la cantidad de analito
inyectado.
 TIEMPO DE RETENCIÓN

Es una función de . Se refiere a la cantidad de tiempo que debe transcurrir

para que el pico más grande del cromatograma de una especie del analito,
llegue al detector después de la inyección de la muestra. En la gráfica
siguiente se puede apreciar como tR:
 Se define mediante la siguiente ecuación:

Donde: tM: tiempo muerto.

ts: tiempo que pasa el analito en la fase estacionaria.

La velocidad lineal promedio de la migración del soluto a lo largo de la columna

(por lo regular, en cm/s) es:

donde L es la longitud de la columna rellena. De manera semejante, la velocidad

lineal promedio u de las moléculas en la fase móvil es:
 FACTOR DE CAPACIDAD
También llamado “factor de retención” k, es un parámetro
experimental importante que se usa con frecuencia para comparar
las velocidades de migración de los solutos en las columnas. En el
caso del soluto A, el factor de retención kA se define como:

Donde kA: constante de distribución del soluto A.

Para obtener kA a partir de un cromatograma, se emplea la

expresión:
 FACTOR DE SELECTIVIDAD
El factor de selectividad a de una columna para los dos solutos A y B se define como:

Donde KB: constante de distribución para la especie más fuertemente retenida B.

KA: constante para la especie A menos retenida.
 Relación entre el factor de selectividad para los dos solutos y sus factores de
retención kA y kB :

 Para determinarlo a partir de un cromatograma experimental, se tiene la

expresión:
 EFICIENCIA DE LA COLUMNA
 La eficiencia de una columna cromatográfica se ve afectada por la cantidad de
ensanchamiento de banda que ocurre a medida que un compuesto pasa por la
columna.

PLATO TEÓRICO:
 Dos términos afines se utilizan ampliamente como medidas cuantitativas de la
eficiencia de una columna cromatográfica, que son la altura de plato H y el
número de platos o cantidad teórica de platos N:

Donde L: longitud del relleno de la columna.

 La eficiencia de la columna aumenta cuanto mayor es N y cuanto menor es H.

 ALTURA DE PLATO TEÓRICO

Es la distancia que el soluto se mueve mientras se lleva a cabo un reparto.

La altura del plato es una buena forma de expresar la eficiencia de la
columna en unidades de longitud, sin especificar la longitud de la columna.
Desde un punto de vista teórico puede relacionarse directamente a las
condiciones experimentales y los parámetros de operación. Para una
columna eficiente H es un número pequeño.

Se define mediante la expresión:

 RESOLUCIÓN DE LA COLUMNA

La resolución Rs de una columna señala qué tan separadas están dos bandas en
relación con sus anchos. La resolución proporciona una medida cuantitativa de
la capacidad de la columna para separar dos analitos.

Viene dada por la siguiente expresión:

Los términos se definen en la figura.

Separación a tres valores de resolución distintos

ENSANCHAMIENTO DE BANDA
Y EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Observaciones:

-El ensanchamiento de la banda depende de la velocidad de

transferencia finita del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria
en cada plato teórico.

-Este ensanchamiento se debe a un avance diferente de las moléculas

de un mismo soluto a través de la columna.

-No todas las moléculas de un mismo soluto fluyen de igual forma en el

mismo instante de tiempo, es decir, no presentan un comportamiento
ideal.
 Ensanchamiento de Banda

En 1950 unos Ingenieros químicos holandeses desarrollaron la ecuación de Van Deemter

Este comportamiento no ideal se debe a tres factores:

1. difusión en remolino.
2. difusión longitudinal.
3. Resistencia a la transferencia de materia.
DIFUSIÓN EN REMOLINO: Se debe a los distintos caminos que
toman las moléculas del soluto al atravesar la fase estacionaria.
Aquellas partículas de soluto que atraviesen canales más
amplios, viajarán más rápido con la fase móvil, y aquellas que
vayan por canales más estrechos viajarán más lentamente.
 (B/U)

DIFUSIÓN LONGITUDINAL
Se debe a que las moléculas del soluto se mueven en distintas
direcciones en la fase estacionaria debido a la porosidad de las
partículas que la forman. Esto hace que algunas moléculas del soluto
salgan retrasadas de la columna respecto a la mayoría-

= factor de obstrucción
 RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE MATERIA: Se
debe a que al pasar la fase móvil por un canal entre las
partículas de la fase estacionaria, no todas las moléculas del
soluto se transfieren a igual velocidad entre la fase móvil y la
fase estacionaria en cada plato teórico.

C=

K= factor capacidad
dF = espesor de la película de la fase móvil
DE= coeficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria.
 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA
ANÁLISIS CUALITATIVO

- Un Cromatograma proporciona Información cualitativa: el tiempo de

retención del analito, el cual, solo puede ser usado controlando bien las
condiciones cromatográficas como: flujo, temperatura, tipo de fase
estacionaria en el caso de gases o composición química de la fase móvil
para el caso de cromatografía liquida, además de que se debe tener
conocimiento de los posibles compuestos presentes en la muestra y una
amplia variedad de patrones para realizar comparaciones. Sin embargo, se
puede dar el caso que dos compuestos tengan el mismo tiempo de
retención, lo que imposibilita su identificación.
ANÁLISIS CUANTITATIVO
  Análisis basados en las áreas de
 Análisis basados en la altura del
los picos
pico

Se pueden realizar estudios cuantitativos de las Las áreas de los picos son independientes de la
muestras separadas a partir de las alturas de los anchura, por lo que estos análisis son más
picos cromatográficos.
precisos que los basados en las alturas de los
La mayor precisión se consigue cuando
picos, aunque su lectura sea más sencilla. Una
tenemos picos bien definidos, agudos,
estrechos y simétricos. Hay que tener en cuenta forma de estimar el área de los picos es
que la altura es inversamente proporcional a la multiplicar su altura por el ancho a la mitad de
anchura del pico, por lo que este método se ve su altura.
muy afectado por las condiciones experimentales
(temperatura de la columna, caudal de la fase
móvil, velocidad de inyección de la muestra…),
por lo que su aplicación es limitada.
 CALIBRACION PATRONES
El método más sencillo para el análisis cromatográfico cuantitativo
requiere la preparación de una serie de soluciones patrón externo de
composición parecida a la de la muestra

A continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se grafican

las alturas o áreas del pico en función de la concentración
 MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO

Este método es conocido como calibración relativa o indirecta. Para ello, la

relación de masas conocidas de un patrón de la muestra y de un estándar que
deber ser preparadas e inyectadas al cromatógrafo, para luego determinar las
relaciones de área. Estas relaciones de áreas se grafican en función de la relaciones
de masa
 MÉTODO DE NORMALIZACIÓN DE ÁREAS

Para aplicar este método, es necesario que se produzca la

elución completa de todos los componentes de la muestra.

En el método de normalización se determinan las áreas de todos

los picos eluidos; tras corregir dichas áreas respecto a las
diferencias en la respuesta del detector a los distintos tipos de
compuestos, se calcula la concentración del analito a partir de
la relación de su área con el área total de todos los picos.
 EJEMPLO:
El método de normalización de áreas se aplicó para la determinación de los
alcoholes butílico normal, secundario, isobutílico y terbutílico. Con la
finalidad de obtener el factor de respuesta relativa de los alcoholes se
preparó una solución patrón de los alcoholes y se observó el cromatograma
de gases. Los resultados fueron los siguientes:
Para una muestra que contiene solo los cuatro alcoholes se obtuvieron los
siguientes datos de área en la segunda columna de la tabla siguiente.
Calcule el porcentaje en peso de cada alcohol presente en la muestra
 PROBLEMAS RESUELTOS

1
2
3
4
 PROBLEMAS PROPUESTOS
1
2 Los siguientes datos corresponden a una columna para cromatografía de
líquidos:

Un cromatograma de una mezcla de las especies A, B, C y D proporciona

los siguientes datos:

Calcule:
a) El número de platos para cada
pico.
b) b) La media y la desviación
estándar de N.
c) c) La altura de plato de la
columna.
 Los siguientes datos se obtuvieron mediante cromatógrafo gas-líquido
3
con una columna rellena de 40 cm:

 Calcule
a) El número de platos promedio a partir de los datos.
b) La desviación estándar para el promedio en a).
c) La altura de plato promedio para la columna.
4 Las áreas relativas de pico para los cinco picos obtenidos por
cromatografía de gases en la separación de cinco esteroides se indican a
continuación. También se proporcionan las respuestas relativas del
detector para los cinco compuestos.

Calcule el porcentaje de cada compuesto en la mezcla.

5 La figura muestra el cromatograma de una mezcla de dos componentes en
una columna cromatografía de líquido empaquetada, de 25 cm. La
velocidad de flujo fue de 0.40 ml..
a)Determine los factores de retención para los componentes.
B)calcula la resolución de los dos picos.
C)Halla la altura media de plato.
D) ¿Qué es longitud de la columna se necesitaría para alcanzar una
resolución de 1.75?
E) Suponga que la longitud de la columna se ha fijado a 25 cm y que el
material de empaquetamiento está fijo. ¿Qué medidas podría usted tomar
a fin de incrementar la resolución para lograr la separación en líneas
base?
F) ¿Hay alguna medida que usted pudiera usar para lograr una mejor
separación en menos tiempo con la misma columna que en el apartado
anterior?
6 Un análisis cromatográfico de un pesticida proporciona un pico con un
tiempo de retención de 8 `58 minutos y una anchura de base de 0`29
minutos. ¿Cuántos platos teóricos intervienen en la separación? Dado que
la columna utilizada para este análisis es de 2`0 metros, ¿qué altura tiene
un plato teórico?