Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental
Bioquímica – Prácticas
Sesión 08: Transaminación
Docente: Ing. Jaime Barreda Del Carpio
Degradación de aminoácidos
Proteínas de Proteínas
la dieta intracelulares
Enzimas Digestivas Enzimas lisosomales
Aminoácidos
α-cetoglutarato
Síntesis
Transaminación
proteica
Glutamato
Cetoácidos Desaminación
ATP NH3
Glucosa Aminoácidos Carbamoil Fosfato Urea
Lípidos no esenciales
Transaminación
Transferencia
reversible
del
Grupo amino
Desde un
α-cetoglutarato Aminoácido Glutamato -cetoácido
Aminoácido
Hacia un
El aminoácido que pierde el grupo amino se
Cetoácido convierte en un Cetoácido y el Cetoácido que
gana el amino se convierte en un aminoácido.
Transaminación
Es catalizada
Transaminasas o
aminotransferasas
Principal
presentes
su
Aceptor
Mayoría de Cofactor del grupo
tejidos amino
animales
Piridoxal
fosfato (PLP) α-cetoglutarato
El PLP es la forma activa de
la vitamina B6
Transaminasas
Alanina aminotransferasa (ALT)
o
Transaminasa Glutámico Pirúvica (TGP)
- -
COO COO
- + -
C O COO H3N C H COO
TGP
+
CH2 + H3N C H CH2 + C O
PLP
CH2 CH3 CH2 CH3
- -
COO COO
α-Cetoglutarato Alanina Glutamato Piruvato
Cetoácido Aminoácido Aminoácido Cetoácido
Transaminasas
Aspartato aminotransferasa (AST)
o
Transaminasa Glutámico Oxalacética (TGO)
- -
COO COO
- + -
C O COO H3N C H COO
TGO
+
CH2 + H3N C H CH2 + C O
PLP
CH2 CH2 CH2 CH2
- - - -
COO COO COO COO
α-Cetoglutarato Aspartato Glutamato Oxalacetato
Cetoácido Aminoácido Aminoácido Cetoácido
Cromatografía en capa fina (CCF)
La fase móvil asciende a través de la fase
estacionaria por capilaridad,
Método de análisis permitiendo la separación de estos
químico compuestos
Permite
Separar varios
componentes de
una mezcla
A través
Afinidad de estos
componentes
Placa de
sílice Disolventes
Fase Fase
estacionaria móvil
Cromatografía en capa fina (CCF)
Identificar determinado
compuesto de una mezcla
Si las manchas se
encuentran en la misma
Es similar Rf de un distancia, significa que
Rf Rf de un compuesto es el mismo compuesto
compuesto conocido
Factor de
retención
Placa de CCF
Para ver las manchas
claramente se puede
usar un revelador.
El revelador de los
aminoácidos es la
ninhidrina.
CO2
Ninhidrina
Reacciona con
NH3 Aminoácidos Grupo α-amino
Ninhidrina Aminoácido
Aldehído con un C Genera
menos que el AA Compuesto
original color
morado
Llamado
En la mayoría de los casos, se forma un
compuesto violeta, sin embargo la prolina Púrpura de
da un color amarillo. Ruhemann
Ninhidrin
a
La ninhidrina es el reactivo químico más
utilizado para la detección de huellas
digitales latentes en superficies porosas
Prolina como papel y cartón. El compuesto
reacciona con aminoácidos presentes en las
huellas digitales.
Púrpura de Ruhemann
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Objetivo
Evaluar la transaminación de la alanina y el aspartato con el α-cetoglutarato en presencia de un preparado enzimático
de hígado de paloma, mediante un método cromatográfico.
Procedimiento b) Luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo
1. Preparación de la fuente enzimática (polvos obtenido es secado a temperatura ambiente,
acetónicos) obteniéndose así polvos secos fáciles de conservar.
a) Los hígados recientemente extraídos de 4 pichones de
paloma son homogenizados en 10 volúmenes de acetona
fría durante 1 minuto.
Transaminación en presencia de un
Experimento 1 preparado enzimático de hígado de pichón.
Procedimiento d) Se decanta el sobrenadante y se completa al
1. Preparación de la fuente enzimática (polvos volumen a 35 mL con agua destilada.
acetónicos)
c) El día de la práctica se muelen en un mortero: 700 mg
de polvos acetónicos con 7 ml de agua destilada y luego 35 mL
se centrifuga el preparado a 2000 rpm por 10 minutos.
700 mg 7 mL
La cetona, por su acción deshidratante facilita la
extracción de enzimas de los tejidos. En esta
forma, la cetona reduce la desnaturalización de las
proteínas y concomitantemente produce
desintegración de las estructuras celulares y la
disrupción de los enlaces lipoproteicos.
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Procedimiento
2. Preparación del experimento de transaminación 1 2 3 4
a) En 4 tubos de ensayo, previamente lavados con
HNO3 concentrado, medir lo siguiente:
Sistemas
Reactivos
1 2 3 4
Alanina 0.05 M 0.2 mL ----- ----- -----
b) Mezclar el contenido de cada
Glutamato 0.05 M 0.2 mL ----- ----- sistema y luego incubar en baño
Aspartato 0.05 M ----- ----- 0.2 mL 0.2 mL María a 37°C, durante 1 hora.
α-cetoglutarato 0.1M 0.2 mL ----- 0.2 mL 0.2 mL
Piruvato 0.1 M ----- 0.2 mL ----- -----
Extracto enzimático 0.2 mL 0.2 mL 0.2 mL -----
Extracto enzimático hervido ----- ----- ----- 0.2 mL 1 hora
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Procedimiento 3. Identificación de los productos de la reacción por
cromatografía de capa fina.
2. Preparación del experimento de transaminación a) Se dispondrá de una placa de vidrio con silica gel (200 x
200 mm) (Fase estacionaria), en la que se ha marcado los
c) Se prepararan 3 estándares, para lo cual medir 0.2 mL
puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con un
de los aminoácidos: Alanina, Glutamato o Aspartato, que
distancia entre ellos de 25 mm, para lo cual se seguirá el
previamente se encuentra a concentración 0.05 M, y
siguiente orden: Uno para cada sistema y tres para los
agregar 0.8 mL de agua destilada.
estándares de: Alanina, Glutamato y Aspartato.
Ala Glu Asp
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Procedimiento
c) Colocar la placa en la cámara cromatográfica
3. Identificación de los productos de la reacción por
conteniendo como solvente 75 volúmenes de fenol y 25
cromatografía de capa fina.
volúmenes de agua (Fase Móvil).
b) Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto
de origen que les corresponde, 10 µL de cada sistema
incubado y 2 µL de las soluciones estándar de los
aminoácidos en alícuotas de no mas de 1 µL cada vez,
dejando secar cada área después de cada aplicación.
d) La cromatografía termina cuando el solvente alcanza la
línea marcada a 10 cm del punto de origen.
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Procedimiento
f) Revelar el cromatograma rociando un solución de
3. Identificación de los productos de la reacción por ninhidrina al 0.1 % en n-butanol saturado con agua y
cromatografía de capa fina. luego dejarla secar.
e) Sacar la placa, secarla en la estufa a 110 oC por 3
minutos.
Revelado
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Resultados
Calcular los Rf x 100 de cada mancha:
Manchas Rf
1
Sistema 1
2
3
Sistema 2
4
5
Sistema 3
6
Sistema 4 7
Estándar de Alanina
Estándar de Glutamato
Estándar de aspartato
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Resultados
Haga la identificación de cada una de las manchas señalando a que
aminoácido corresponde en base a sus valores Rf:
Manchas Aminoácido
1
Sistema 1
2
3
Sistema 2
4
5
Sistema 3
6
Sistema 4 7
Transaminación en presencia de un
Experimento preparado enzimático de hígado de pichón.
Resultados
Interpretación de los resultados obtenidos:
Sistema 1:
Sistema 2:
Sistema 3:
Sistema 4:
