SEMINARIO-TALLER

Metodología de separación y
purificación .Cromatografía : definición y
clasificación.

Cátedra de Química Biológica 1

Departamento de Bqca.
Fcny Cs.
Unpsj
2018
Objetivos
• Construir definiciones importantes para la comprensión del concepto de
cromatografía.
• Analizar los procesos involucrados en el fenómeno de separación.
• Construir la clasificación de los tipos de cromatografías.
• Analizar los diferentes tipos de cromatografía y su aplicaciones.
 INTRODUCCIÓN

CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)

Separación de biomoléculas… • proteínas

• péptidos
• aminoácidos
• lípidos
• ADN/ARN …

… en función de su diferente distribución análisis y

en dos FASES (¡siempre!)
purificación

Botánico
F. MÓVIL:líquido (solvente) Ruso
A Mikhail
gas
Tswett
B
F. ESTACIONARIA: sólida líquida ( 1906)
FASE FASE ESTACIONARIA
MÓVIL
• Separación de los componentes de una muestra.

• Los componentes de una mezcla son distribuidos entre dos fases: una es
estacionaria y una móvil.

• La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido soportado en un sólido o en

un gel (matriz).

• La fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna, extendida en una

capa, distribuida como una película, etc...
• La fase móvil , que contiene la mezcla a separar, puede ser un líquido o un gas.
• La separación entre dos sustancias comienza cuando una es retenida más
fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse más
rápidamente en la fase móvil.

• Las retenciones pueden tener su origen en dos fenómenos de interacción que se

dan entre las dos fases:

• Adsorción: que es la retención de una especie química por parte de los puntos
activos de la superficie de un sólido quedando delimitado el fenómeno a la
superficie que separa las fases o superficie interfacial.

• Absorción: que es la retención de una especie química por parte de una masa y
debido a la tendencia que esta tiene a formar mezcla o a reaccionar
químicamente con la misma.
 CLASIFICACIÓN
3 CRITERIOS
1- Según el estado físico de la fase móvil:

FASE MÓVIL líquido  Cromatografía de LÍQUIDOS

gas  Cromatografía de GASES

2- Según la causa por la que se separan los componentes de la muestra

(relacionado con las propiedades físicas de las biomoléculas):

• Solubilidad • Hidrofobicidad
• Tamaño • Interacciones por afinidad biológica
• Carga • Interacciones inespecíficas

3- Según la metodología utilizada para el desarrollo de la cromatografía

(relacionado con la fase estacionaria):

FASE ESTACIONARIA  Sobre superficie plana: planar

 En columna
 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Fase Fase Tipo
móvil estac. Clase (propiedad) Nombre Ejemplo
Líquida Líquida Reparto Solubilidad Fase normal EN PAPEL

Fase inversa

Tamaño Exclusión GEL FILTRACIÓN

Interacciones Intercambio INTERCAMBIO

Sólida Adsorción
electrostáticas iónico IÓNICO
(¡NO
absorción!) Hidrofobicidad Interacción EN CAPA FINA o TLC
Hidrofóbica
HIDROFÓBICA

Interacciones Afinidad AFINIDAD (GST)

por afinidad

Interacciones Adsorción HIDROXIAPATITO

inespecíficas
 CROMATOGRAFÍA EN SUPERFICIE PLANA
CÁMARA
F. ESTACIONARIA
CROMATOGRÁFICA
(polar)

FLUJO
propiciado por
MUESTRA
CAPILARIDAD

FASE MÓVIL
FRENTE de avance del solvente (apolar)

distancia avanzada por la molécula

hidrofóbica Rf=
distancia avanzada por el frente

Rf es característico para cada soluto para

hidrofílica una composición dada de fase móvil y un
determinado tipo de superficie
 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
PROPIEDAD: Solubilidad

SOPORTE  celulosa del papel

F. ESTACIONARIA  (LÍQUIDA) H2O absorbida en la celulosa.

F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

H2O H2O
H2O H2 O
H2O H- H2O
H-
H2 O H- H2O
H2
H OO
2 H2O

Molec. Hidrofílica  LENTA Molec. Hidrofóbica  RÁPIDA

Retenida por [Link] Disuelta en f. móvil
 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
PROPIEDAD: Hidrofobicidad

SOPORTE  plancha de metal o vidrio

F. ESTACIONARIA  (SÓLIDA) sólido pulverizado sobre

plancha de metal o vidrio. El más usado es el gel de sílica.

F. MÓVIL  (LÍQUIDA) Disolvente orgánico

-Si-OH H- -Si-OH
-Si-OH H- -Si-OH
-Si-OH H- -Si-OH
-Si-OH -Si-OH
-Si-OH -Si-OH

Molec. Hidrofóbica  RÁPIDA

Molec. Hidrofílica  LENTA
Disuelta en f. móvil
Retenida por f. estacionaria
• Adsorbente: cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte.

• Adsorbentes más utilizados son:

• Celulosa
• Almidón
• Azucares
• Gel de sílice (silicagel)
• Óxido de aluminio (alúmina)
• Carbón activo (carbón en polvo)
• Gel de sílice o silicagel es uno de los más utilizados.

• pH entre 4-5
• tamaño del grano de 10 a 40 µ
• tamaño de poro de 20 a 150 Å

• Agente aglomerante: yeso (sulfato de cálcico) proporciona firmeza al adsorbente

• Adsorbente polar
• Puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH de forma que se haga apto
para separar componentes lipofílicos (esteroides, ácidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles).
Proceso llamado cromatografía de fase reversa
• La alúmina u óxido de aluminio

• Adsorbente ligeramente básico debido a la presencia de moléculas de hidróxido de aluminio

adheridas a la alúmina.

• Puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas ácidas, básicas y neutras.

• Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas.

• adsorbente de carácter polar, retendrá con mayor avidez a los componentes polares.

• El adsorbente se prepara en agua destilada. Proporción : dos partes de agua y una de adsorbente.
Ver fabricante

• Soporte del adsorbente láminas de vidrio

• El espesor de la placa en general suele ser de:

• 0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas

• 0.5- 2 mm. para separaciones preparativas

• La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades

• Se dejan reposar

• Activar el adsorbente: dejar las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente o calentar
30 minutos a 105-110 ºC
• Aplicación de la muestra

• Los compuestos a separar se disolverán en un solvente orgánico con punto de

ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación.

• mezcla cloroformo: metanol (1:1).

• disoluciones al 1% de las muestras, aplicar 2 µl,carga 20 µg de producto sólido.

• Siembra: micropipetas y tubos capilares.

• Se realiza tocando con la punta del capilar sobre el papel cromatográfico dejando una
distancia al borde inferior y entre muestras de un centímetro aproximadamente.

• Se deja secar para evaporar el disolvente, solo quedará la muestra a analizar

• La elección del eluyente o fase móvil dependerá lógicamente del componente que se va
a separar y del material en que la separación se lleva a cabo.

• Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

• Eter de petróleo
Eter dietílico
Ciclohexano
Acetato de etilo
Tetracloruro de carbono
Piridina
Benceno
Etanol
Cloroformo
Metanol
Diclorometano
Agua
Ácido acético
• Desarrollo de la cromatografía

• Ascendente: el eluyente asciende en forma vertical, por la acción de la capilaridad

• La cromatografía se realiza en una cuba. El eluyente se introduce en la cámara una hora

antes del desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera.

• El tiempo de desarrollo suele ser corto en analítica, en una cromatografía preparativa

puede llevar horas.

• La cromatografía puede desarrollarse durante un tiempo prefijado o hasta que se alcance

una línea dibujada a una distancia fija desde el origen para estandarizar los valores de RF.

• El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde

• Se deja secar el papel por acción del aire

• Localización de sustancias o revelado
• Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posición de
dichos compuestos:

• Métodos químicos
• Métodos físicos

• Métodos químicos
• Reacción química entre un reactivo revelador y los componentes separados.

• Se pulveriza con los reactivos reveladores en posición horizontal y bajo campana.

• Por bañado del papel sumergiéndolo en un recipiente adecuado con el revelador.

• Reveladores generales

• Reactivo yodo: forma complejos coloreados con los componentes orgánicos (con
tonos amarillo-marrón). Las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es
conveniente señalar las manchas aparecidas: reversible y no destructivo.

• Acido sulfúrico: reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas

negras: Irreversible y destructivo

• Reveladores específicos

• 2,4 – dinitrofenilhidracina: para aldehidos y cetonas

• Verde de bromocresol: para ácidos carboxílicos
• Paradimetil aminobenzaldehido: para aminas
• Ninhidrina: para aminoácidos
• Métodos físicos

• Al colocar el cromatograma bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y

de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes.
• Constantes Rf
• RF (Ratio of Front) es una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una
placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente.
• Se define como:

• La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la

mancha.

• RF reproducibles: deben fijarse tipo de papel, fase móvil, fase estacionaria, cantidad
de muestra.

• máximo valor de RF: es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.

 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
EMPAQUETADO APLICACIÓN
ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
COLUMNA MUESTRA

RESERVORIO
LECHO f. móvil
CROMATOGRÁFICO
f. estacionaria

COLUMNA MUESTRA

FLUJO
gravedad

DIFUSIÓN

llave

SEPARACIÓN
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

PERFIL DE ELUCIÓN

FRACCIONES Moléc. distribuida en

f.móvil
Moléc. distribuida en
[Link]

respuesta del detector

ANÁLISIS DEL
1 2 3 4 5 6 7 8 9
CONTENIDO DE LAS
FRACCIONES

Cromatograma: gráfica de Espectrofotométrico

alguna función de la
Abs 280nm – Proteínas
concentración de un soluto Otras Abs - Colorantes
frente al tiempo de elución o el 1 2 3 4 5 6 7 8 9
volumen de elución fracción
Tiempo de
retención

Longitud de la
columna

Resolución de
la columna
 CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN
PROPIEDAD: Tamaño (y forma)

SOPORTE  Resina de micropartículas esféricas formadas

por polímeros hidrofílicos: dextrano, agarosa, poliacrilamida o
mezcla de ellos

Tamaños de poro  intervalo o rango de fraccionamiento.

FASE MÓVIL
Sephadex G25: 1000 – 5000 Da
Sephadex G200: 5000 – 250000 Da

MICROPARTÍCULAS
F. ESTACIONARIA
F. ESTACIONARIA  LÍQUIDA solvente acuoso (el
mismo que el de la fase móvil) que se encuentra dentro de
micropartículas.

F. MÓVIL  LÍQUIDA solvente acuoso que atraviesa la

columna por los espacios intersticiales (entre las
micropartículas).
 CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN
Molec. GRANDES  RÁPIDAS

Avanzan con mayor velocidad a través de los

espacios intersticiales: afinidad con fase
móvil

Molec. PEQUEÑAS  LENTAS

Son retenidas por las fibras de las

APLICACIÓN micropartículas y avanzan con menos
MUESTRA
velocidad: afinidad con fase estacionaria
PERFIL DE ELUCIÓN
grande
pequeña

respuesta del detector

ELUCIÓN

1 2 3 4 5 6 7 8 9
fracción
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

PROPIEDAD: Interacciones electrostáticas (carga)

SOPORTE  Resina de micropartículas formadas por polímeros

sintéticos o naturales (dextranos, celulosas, agarosa).

F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Grupos con cargas iónicas unidos FASE MÓVIL

al soporte

Carga positiva (+)  intercambiadores de aniones (-):

cromatografía intercambio aniónica
Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+):
cromatografía intercambio catiónica
F. ESTACIONARIA
F. MOVIL  LÍQUIDA Solvente que anula la interacción
electrostática. MICROPARTÍCULAS

2 posibilidades: Gradientes de pH  cambio de carga de

las moléculas de la muestra
Gradientes iónicos (salinos)  competencia
por grupos electrófilos
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
•Gradiente de pH
Molec. CARGA (-)  NO SE RETIENEN
•Gradiente salino

Molec. MENOR CARGA (+)  RÁPIDAS

Son desplazadas más fácilmente por la fase móvil

Molec. MAYOR CARGA (+)  LENTAS

Son retenidas por los grupos cargados iónicamente de

la fase estacionaria

PERFIL DE ELUCIÓN
APLICACIÓN
MUESTRA q+
Q+

respuesta del detector

+

Na+
ELUCIÓN

-
1 2 3 4 5 6 7 8 9
fracción
Las proteínas
presentan carga a
distintos pH debido a
sus pI
 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

PROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculas

hormona-receptor
proteína-metal o cofactores como ATP
antígeno-anticuerpo

SOPORTE  Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga, con

rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica). FASE MÓVIL

F. ESTACIONARIA  SÓLIDA Ligandos (grupos químicos)

específicos unidos a la matriz

-- Comerciales: Concavalina A  une glicoproteínas

Proteína A  une IgG (anticuerpos)
-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz
F. ESTACIONARIA
MICROPARTÍC
F. MÓVIL  LÍQUIDA Solución que anula o disminuye la afinidad con ULAS
el ligando de la fase estacionaria.

-- Solución con el propio ligando  Molécula + ligando libre

-- Solución con algo que interacciona con el ligando  Molécula
 CROMATOGRAFÍA
DE AFINIDAD
Molec. NO INTERACCIÓN  RÁPIDAS

No se unen al ligando de la fase estacionaria

Molec. INTERACCIÓN  LENTAS

Se unen al ligando de la fase estacionaria

Elución específica.

PERFIL DE ELUCIÓN

ELUCIÓN
LAVADO ESPECÍFICA

respuesta del detector

molécula

APLICACIÓN
MUESTRA

LAVADO
ELUCIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ESPECÍFICA fracción
Cromatografía Líquida de Alta Resolución.
• La muestra debe ser soluble en solventes orgánicos o acuosos, sin importar el peso
molecular.
• La fase móvil no debe disolver ni alterar químicamente la fase estacionaria .
• Si se utilizan más de dos solventes deben ser totalmente miscibles entre sí.
• Adsorción: compuestos lipofílicos, de polaridad baja o intermedia, a veces, isómeros.
• Partición ( polar o apolar): isómeros, oligómeros y mezclas complejas.
• Intercambio iónico
• Exclusión molecular
 HPLC Cromato
grafía Convencional
Formatos de columnas
Diámetro 4-10 mm 1-10cm
• Largo
Alta eficiencia. 3-30 cm 5-150 cm
• Fases
Altaestacionarias
resolución cromatográfica. HPLC utiliza
Diámetro de partículas 3-10 µm 50-150 µm
bombas de alta
presión.
N 2000-15000 Menor a 2000 Disminuye el
H 20 µm 1mm tiempo de
retención y
Condiciones de operación
aumenta la
Presión 30-400 atm Menor 2,5 atm resolución.
F 0,3-1,5 ml/min 0,1-20 ml/min
Volumén de muestra 5-500 µm 0,5-100 ml
Cromatogramas Suelen expresarse en Suelen expresarse en
términos de Tr términos de Ve
SEPARACIÓN OPTIMA
• COMPLETA: Separación de todos los componentes.

• DE CALIDAD: Separación de cada uno de los componentes.

• EFICIENTE: Equilibrio entre tiempo y costos.

 CROMATOGRAFÍA GASEOSA
PROPIEDAD: Adsorción o Absorción
Ideal para la separación de compuestos volátiles

SOPORTE  Columna (metal, vidrio o teflon) empacadas o

rellenas ( tierra de diatomea calcinado)
Tubular abierta (10- 100 m de longitud).
Ideal para mezcla de compuestos con
volatilidades muy diferentes.

F. ESTACIONARIA Un sólido poroso partícula do. Adsorción

Una película líquida ( cubre el sólido particulado).
Una película líquida delgada depositada sobre la pared Absorción

interna de la columna. .
Baja volatilidad, químicamente inerte, estabilidad térmica.
Cierta solubilidad con la muestra
F. MÓVIL  gas, llamado gas portador o carrier (nitrogeno,
Helio o Hidrogeno).
Cromatografía Gaseosa
Aplicaciones
• Determinación de ácidos grasos.
• Determinación de terpenos.
• Determinación de hidrocarburos derivados del petróleo.
MUCHAS GRACIAS Y
EXCELENTE DÍA