2- EXTRACCIÓN DE

PROTEÍNAS Y ÁCIDOS
NUCLÉICOS
- Descripción, manejo y mantenimiento de equipos de extracción.
- Extracción de proteínas.
- Extracción de cadenas nucleotídicas.
- Contaminantes en la preparación y extracción de muestras.
- Registro, etiquetado y conservación de los productos extraídos
hasta su análisis
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Termociclador
• Equipo para hacer PCRs

• Rango de temperatura de 4 °C a

98 °C.
• La tapa incluye una placa a 103-

120 °C para evitar la

condensación de agua en las
tapas de los tubos.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Termociclador
• En el termociclador se programan ciclos rápidos y

continuos para los procesos de la PCR

2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Termociclador
• Para el mantenimiento:

• Limpiar los pocillos con torundas

• Limpiar la tapa que se calienta

• NO marcar las muestras con rotulador

• Mantener el sistema de ventilación

2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Cabinas de flujo laminar
• Una cabina de flujo laminar, cámara de flujo laminar o

campana de flujo laminar es un recinto que emplea un

ventilador para forzar el paso de aire a través de un filtro
y proporcionar aire limpio a la zona de trabajo libre de
partículas de hasta 0.1 mm.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Cabinas de flujo laminar
• Dentro de estas cabinas o campanas se trabaja con

cultivos celulares o cualquier otro sistema que deba

mantenerse limpio y deba evitarse la contaminación.
• Estas cabinas están diseñadas para proporcionar un aire

limpio y constante
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Cabinas de flujo laminar
• Las cabinas de este tipo existen tanto en configuración

vertical como en horizontal, según que la posición del

filtro esté en la parte superior o en la parte trasera de la
zona de trabajo
• El flujo de aire siempre va hacia el operador

• Estos equipos ofrecen protección únicamente a la muestra que se

maneja en su interior, pero nunca al operador.

2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Cabinas de flujo laminar
• Las cabinas de flujo

laminar pueden tener una

lámpara de rayos
ultravioleta con acción
germicida para esterilizar
el recinto y su contenido,
antes de utilizarlo.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Cabinas de extracción de gases
• Muy parecido a las cabinas de flujo

laminar, pero en vez de tener una

corriente de aire hacia el usuario, hay
una campana extractora para que los
vapores nocivos de ciertas sustancias
no se concentren.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Centrifugas refrigeradas
• Una centrifugadora es una máquina que pone en rotación

una muestra para –por fuerza centrífuga– acelerar la

decantación o la sedimentación de sus componentes o
fases (generalmente una sólida y una líquida), según su
densidad.
• IMPORTANTE: A la hora de meter las muestras a la

centrifuga, hay que compensar el peso de los lados.

2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.

5.000 rpm
12.000 rpm
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Centrifugas refrigeradas
• Motor

• Rotor (donde se coloca la muestra por centrifugar):

• Fijos. Los tubos se alojan con un ángulo fijo con respecto al eje de giro. Se

usan para volúmenes grandes.

• Basculantes. Los tubos se hallan dentro de carcasas colgantes, unidas al

rotor con un eje. Se mueven cuando el mecanismo centrifugador gira. El

mecanismo centrifugador está colocado en el interior de una cámara
acorazada, a unos 4 ºC. Si no existiera esta cámara, al comenzar la
centrifugación, debido al rozamiento con el aire, se incrementaría la
temperatura de la muestra y podría desnaturalizarse.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Centrifugas refrigeradas
• Tener cuidado con los ciclos de enfriamiento, porque se

puede formar escarcha.

• Asegurar que los filtros de ventilación no están obstruidos

• Asegurarse de que el rotor está bien sujeto antes de

empezar a utilizarlo.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
pHmetro
• Un pHmetro o medidor de pH es un instrumento científico

que mide la actividad del ion hidrógeno en soluciones

acuosas, indicando su grado de acidez o alcalinidad
expresada como pH.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
pHmetro
• Mediciones muy precisas requieren que el medidor de pH

se calibre antes de cada medición.

• La calibración se realiza con al menos dos soluciones

tampón estándar que abarcan el rango de valores de pH

a medir. Para fines generales, son apropiados tampones
a pH 4,00, pH 7,00 y pH 10,00.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Balanza
• Calibración con un material de referencia certificado
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Estufa o incubadora
• Mantenerlos limpios y calibrar la temperatura interna con

un termómetro de vez en cuando

2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Baños termostatizados
• Cambiar el agua cada cierto tiempo, porque si no suelen

aparecer precipitados. Verificar que el sistema de

agitación no tenga ningún problema (Poner aceite, etc...)
y que la temperatura es la adecuada.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Baños termostatizados
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Sistemas de electroforesis
• Son unas cubetas para hacer las electroforesis (separación de

fragmentos de macromoléculas por tamaño).

• Las electroforesis de DNA y proteína requieren cubetas

distintas.
• Las cubetas se unen a un sistema de alimentación para crear

una corriente continua dentro de la cubeta.

• Cada uno tiene su buffer específico para correr los geles.

• Cuando terminemos conviene limpiar seguido y dejarlas secar.

2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Transiluminador
• Es el aparato por el cuál vemos los resultados de las

pruebas que hayamos hecho tanto con DNA, como con

proteínas:
• DNA: Electroforesis, Southern-Blot, Dot-Blot...

• Proteína: Western-Blot
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Transiluminador
• Hay dos tipos de transiluminadores.

• Cerrados: Son como una gran estufa y en la parte superior

incorporan una cámara. Tienen un software que lo controla.

• Abiertos: Son como una pantalla
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Espectofotómetro
• El espectrofotómetro es un instrumento con el que se

apoya la espectrofotometría para medir la cantidad de

intensidad de luz absorbida después de pasar a través de
una solución muestra.
• Sus aplicaciones pueden ser cualitativas y cuantitativas.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Agitadores
• En la biología molecular hay muchos pasos que implican

la incubación de las muestras y durante la incubación los

queremos mantener homogéneos.
• Las incubaciones O/N de los cultivos líquidos conviene

hacerlos en agitación.
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
Agitadores
2.1- Descripción, manejo y mantenimiento de
equipos de extracción.
• Con cada equipo, planteame una situación en la que lo

utilizarías
• En los protocolos de extracción de DNA y Plásmidos,

¿qué equipos de laboratorio necesitamos?

2.2- Extracción de proteínas.

• La extracción de proteínas es un paso de preparación de

muestras esencial en la proteómica.

• Las proteínas pueden ser extraídos de plantas y animales

de tejido, levaduras y microorganismos.

2.2- Extracción de proteínas.

• Cuando se purifican las proteínas para estudios

funcionales o estructurales, o para procesamiento

preparativo y producción, el primer paso es romper las
células o el tejido para tener acceso a las proteínas
específicas.
2.2- Extracción de proteínas.

• La lisis celular y la solubilización de proteínas son

fundamentales para un análisis eficaz y un procesamiento

eficiente.
2.2- Extracción de proteínas.

• Se dispone de numerosos métodos para romper las

células y preparar su contenido para el análisis.

• Se emplean métodos suaves cuando la muestra consiste en

células cultivadas fácilmente lisadas o células sanguíneas.

• Se utilizan métodos más vigorosos para la ruptura de células

vegetales o bacterianas más robustas.

2.2- Extracción de proteínas.

• La finalidad del extracto proteico determinará el buffer de

extracción que se utilizará dependiendo se desea o no que

las proteínas conserven su actividad biológica, su
conformación nativa, su interacción con otras proteínas u
otras moléculas.
• Algunos protocolos son tan violentos que involucran la

ruptura de todas las membranas; otros en cambio permiten

fraccionar y obtener, distintos componentes subcelulares
(núcleos, mitocondrias, etc).
2.2- Extracción de proteínas.

• Lisis con detergente: La lisis con detergente es un método

suave que puede utilizarse para las células de mamíferos, las

células bacterianas, las levaduras y las plantas.
• Las suspensiones celulares se centrifugan suavemente y se

vuelven a suspender en una disolución de lisis con detergentes

que actúan rompiendo la membrana celular. Las membranas
se solubilizan, lisando las células y liberando su contenido.
• Es posible que sea necesario retirar los detergentes más

adelante si interfieren en el análisis o la producción.

2.2- Extracción de proteínas.
2.2- Extracción de proteínas.

• Lisis por congelación-descongelación: Este método es

aplicable a las suspensiones de células de mamífero o células

bacterianas.
• La suspensión celular se congela rápidamente utilizando

nitrógeno líquido. La muestra se descongela después y se

vuelve a suspender mediante pipeteo o agitación suave en
tampón de lisis, repitiendo el proceso varias veces.
• Entre los ciclos la muestra se centrífuga y el sobrenadante

que contiene la proteína soluble se conserva.

2.2- Extracción de proteínas.

• Choque osmótico

• Se define ósmosis como una difusión pasiva,

caracterizada por el paso del agua, disolvente, a través

de la membrana semipermeable, desde la solución más
diluida a la más concentrada.
2.2- Extracción de proteínas.

Choque osmótico
• Las membranas de las células son semipermeables, por lo tanto, en un

medio isotónico, el paso del agua en los dos sentidos se equilibra. Si la

célula se encuentra en un medio hipotónico (que tiene menor
concentración de soluto) tenderá a absorber agua hinchándose, pudiendo
llegar al extremo de estallar, dando origen a la citólisis.

• Por el contrario, si la célula se encuentra en un medio hipertónico, el agua

interior tenderá a salir, llevando a la deshidratación, pudiendo en casos

extremos llegar a la muerte de la célula, proceso denominado de
crenación.
2.2- Extracción de proteínas.

Choque osmótico
• Las membranas de las células son semipermeables, por lo tanto, en un

medio isotónico, el paso del agua en los dos sentidos se equilibra. Si la

célula se encuentra en un medio hipotónico (que tiene menor
concentración de soluto) tenderá a absorber agua hinchándose, pudiendo
llegar al extremo de estallar, dando origen a la citólisis.

• Por el contrario, si la célula se encuentra en un medio hipertónico, el agua

interior tenderá a salir, llevando a la deshidratación, pudiendo en casos

extremos llegar a la muerte de la célula, proceso denominado de
crenación.
2.2- Extracción de proteínas.

Choque osmótico:
• Éste es un método muy suave que puede ser suficiente

para la lisis de células bacterianas o de mamífero

suspendidas sin la utilización de un detergente.
• Las células son primero expuestas a un medio de alta

presión osmótica y luego se cambia a un medio diluido.

La célula empieza a absorber agua hasta el punto de
explotar.
2.2- Extracción de proteínas.
2.2- Extracción de proteínas.

Ultrasonidos:
• Este método de extracción de proteínas se aplica más a

menudo a las suspensiones celulares.

• Las células se rompen mediante ondas sonoras de alta

frecuencia a través de una sonda insertada en la

muestra.
• Las ondas sonoras causan la ruptura de las membranas

celulares.
2.2- Extracción de proteínas.
2.2- Extracción de proteínas.

• Métodos mecánicos: Las proteínas pueden extraerse de

las células y los tejidos utilizando varias medidas toscas

pero eficaces de «trituración y molienda».
• Las membranas celulares pueden romperse por fuerzas

mecánicas líquidas utilizando bolitas pequeñas

• Los tejidos pueden ser homogeneizados utilizando equipos que

aplican grandes presiones sobre la muestra.

2.2- Extracción de proteínas.

• Métodos mecánicos:

• Los tejidos o las células pueden congelarse en nitrógeno líquido y

molerse hasta un polvo fino utilizando un mortero y un almirez con

alúmina o arena.

• La agitación rápida de las células con microesferas de vidrio finas

rompe las paredes celulares. Esto es eficaz para la mayoría de las

bacterias gramnegativas y grampositivas.
2.2- Extracción de proteínas.
2.2- Extracción de proteínas.

Digestión enzimática:
• Los métodos enzimáticos se utilizan a menudo cuando se

quieren extraer proteínas de bacterias, levaduras o

células eucariotas incluidas en tejidos fibrosos donde las
membranas celulares están rodeadas por una estructura
protectora robusta.
2.2- Extracción de proteínas.

Digestión enzimática:
• Las enzimas de lisis celular, o cócteles como Lysozyme, Mutanolysin,

MetaPolyzyme, Lysonase y Pronase, pueden utilizarse en combinación

con enzimas de digestión tisular (colagenasa, condroitinasa,
hialuronidasa) para disolver o desorganizar las paredes celulares, los
revestimientos, las cápsulas, las cápsides u otras estructuras que no se
rompen con facilidad sólo por medios mecánicos.
• La digestión enzimática puede ir seguida de homogenización,

tratamiento con ultrasonidos o agitación vigorosa en Vórtex en un

tampón para lisis.
2.2- Extracción de proteínas.
2.2- Extracción de proteínas.

• Además, dado que tras la ruptura celular pueden

liberarse proteasas y fosfatasas endógenas y degradar la

molécula diana, la muestra debe protegerse durante la
ruptura celular y la subsiguiente purificación
utilizando inhibidores de proteasas y de fosfatasas para
evitar la pérdida incontrolada de la diana.
2.2- Extracción de proteínas.

• A la hora de trabajar con proteínas debemos tener en

cuenta ciertas características:

2.2- Extracción de proteínas.

• La solubilidad de la proteína dependerá de la

composición aminoacídica de las proteínas.

• Si tiene muchos aminoácidos polares tendrá gran solubilidad.

• Si tiene muchos aminoácidos apolares no será tan soluble.

• La desnaturalización de la proteína significa que pierde

su conformación plegada y por tanto se vuelve inactiva. A

veces la desnaturalización es reversible pero a veces no.
2.2- Extracción de proteínas.

• A la hora de extraer nuestra proteína debemos mirar que el pH

del buffer que vamos a utilizar no sea ni demasiado ácido ni

demasiado básico. Las proteínas son moléculas con carga por
lo cual el pH del medio les afecta mucho.
• El punto Isoeléctrico es el pH en el cuál la proteína tiene una

carga neta zero.

• A un pH por debajo de su pI, las proteínas tienen una carga positiva neta.

• A un pH por encima de su pI, las proteínas llevan una carga neta

negativa.
2.2- Extracción de proteínas.

• Una vez fuera de la célula, las proteínas quedan

expuestas a posibles degradaciones.

• Para evitarlo, se las muestras se mantienen en todo

momento a 4 ºC en los buffers adecuados.

• A veces se incluyen sustancias químicas inhibidoras de

proteasas (enzimas que degradan proteínas).

• Para deshacernos de los ácidos nucléicos podemos

hacer tratamientos con DNAsas.

2.2- Extracción de proteínas.

• Después de la lisis, las muestras se someten a

centrifugación a para eliminar los restos celulares y

separa el sobrenadante (las proteínas).

• El sobrenadante será el extracto proteico crudo que

utilizaremos para nuestros experimentos.

2.2- Extracción de proteínas.

• Cuando hacemos una extracción de proteínas, ¿qué

extraemos?
• Si no hiciésemos tratamientos contra el DNA, ¿qué

pasaría con la muestra?

• Con un extracto proteico, ¿qué tipo de experimentos

podemos hacer?
2.2- Extracción de proteínas.

• ¿Cuando hacemos una extracción de proteínas, qué

extraemos?
2.2- Extracción de proteínas.

• Si no hiciésemos tratamientos contra el DNA, ¿qué

pasaría con la muestra?

2.2- Extracción de proteínas.

• Con un extracto proteico, ¿qué tipo de experimentos

podemos hacer?
Video

• https://

[Link]/watch?v=7Hk9jct2ozY&ab_channel=W
EHImovies
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• Para su estudio los ácidos nucleicos deben aislarse del

resto de los componentes celulares, como lípidos y

proteínas, más abundantes que los ácidos nucleicos.
Asimismo, dependiendo del objeto de estudio debe
aislarse de preferencia el ADN o ARN;
• Para estudios de niveles de expresión génica se extraerá ARN

• Para la búsqueda de modificaciones o alteraciones génicas, ADN.

2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• ¿Cuál es la diferencia entre en DNA y RNA?

• ¿Qué información nos puede dar el RNA que

el DNA no nos puede dar?

2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• Los fragmentos de ADN generalmente obtenidos por las

técnicas de extracción de ADN oscilan entre 100 y 150 kb

y son adecuados para Southern blot, reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), electroforesis y construcción de
bibliotecas genómicas.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

Elección del método de extracción

• Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de

cadena sencilla (ADNss), DNAds, ARN total, ARN

mensajero (ARNm) o ARN ribosomal (ARNr).
• Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas,

procariotes o virus.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

Elección del método de extracción

• Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido, sangre,

expectoración, suero, orina, líquido cefalorraquídeo,

etcétera.
• Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído:

• Según el uso que vaya a tener el ácido nucleico los requerimientos

de rendimiento, pureza y tiempo de extracción variarán acorde a la

metodología que se vaya a aplicar, como retrotranscripción, PCR,
clonación, Northern blot, Southern blot, etcétera.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• El ADN genómico suele extraerse para su uso en

procesos como una PCR cualitativa o Southern blot, para

diagnóstico, determinación de variantes alélicas o
clonación en vectores.
• El ARN se extrae para realizar una reacción de

retrotranscripción y, posteriormente, una PCR que

determine los niveles de expresión génica en condiciones
y momentos determinados.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• Es una técnica minuciosa, que involucra:

• Lisis de la célula

• Separación

• Purificación

• Precipitación

• Lavado

• Disolución.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• Durante la extracción de ácidos nucleicos, en particular

del ARN, que es una molécula más lábil ya que es de

cadena sencilla, debe considerarse el uso de material
nuevo, estéril, libre de ADNsas y ARNsas, y el uso de
guantes para impedir la degradación, así como para
impedir cualquier contaminación con ácidos nucleicos
exógenos. 
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• Todo el proceso debe realizarse en frío; esto es, con los

reactivos y las muestras a 4°C antes y durante el

proceso, conservando la muestra congelada hasta justo
antes de iniciar la extracción.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• Las técnicas comunes de extracción de ácidos nucleicos

son muy diversas e incluyen procesamientos químicos y

físicos que las diferencian; cada una presenta ventajas y
desventajas.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• ¿Qué técnicas para extraer DNA hay?

Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

• Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células

y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de

detergentes con la posterior eliminación de las proteínas
mediante su extracción y la de componentes lipídicos con
solventes orgánicos.
• Esto deja al ADN puro listo para su separación por

precipitación en soluciones alcohólicas. Es la técnica más

empleada, por la cantidad y la calidad del ADN obtenido. 
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo.

Lisis de las células y liberación del ADN

• El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y

la lisis con detergentes (Triton o docedil sulfato sódico, SDS)

capaces de romper las membranas celular y nuclear, y liberar el
ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN.
• El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser lo

suficientemente agresivo como para lograr la fragmentación del

tejido y la rotura de la membrana celular, sin dañar el ácido
nucleico.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Lisis de las células y liberación del ADN

• La disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo

en un buffer de lisis, que contiene sales, un detergente y

proteinasa K (opcional), que libera el ADN de las histonas con las
que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas celulares.
• La incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65°C. En el

caso del ADN, la homogeneización se lleva a cabo con un

homogeneizador manual para evitar la rotura mecánica de la
molécula.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Lisis de las células y liberación del ADN

• La inactivación de nucleasas intracelulares previene la

digestión enzimática de los ácidos nucleicos, lo que

permite lograr la obtención de fragmentos relativamente
largos de ADN y ARN. La lisis celular y la inactivación de
las nucleasas intracelulares en general se llevan a cabo
en el mismo paso, ya que la solución de lisis está
compuesta por sales que inactivan las ADNasas.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos

• Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo, se

utiliza una solución que tiene una relación [Link] v/v para
el fenol: cloroformo: alcohol isoamílico; generalmente se
añade hidroxiquinolina al 0.1%,un inhibidor parcial de
ARNsas.
• Esta solución desnaturaliza las proteínas (entre ellas las

nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y

acuosa tras la centrifugación de la muestra.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos

• La eliminación de las proteínas y componentes no

hidrosolubles del homogenado celular se efectúa con la

formación de dos fases con propiedades de solubilidad
particulares 
• Una fase orgánica (fenólica) en la parte inferior del tubo de precipitado

que contiene lípidos, proteínas y debris celulares.

• Una fase acuosa en la parte superior (menos densa), que contiene los

ácidos nucleicos y otras pequeñas moléculas hidrosolubles.

• En la interfase se ubican la mayor parte de las proteínas.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos

• El ADN es poco soluble en fenol, por lo que previamente

suele estabilizarse con una solución amortiguadora de

Tris que lo mantiene en un pH de 8.0 a 8.5, lo que hace
que el ADN permanezca en la fase acuosa. La
modificación del pH de 8.5 a 5.2 en esta solución puede
favorecer la extracción de ARN frente a la de ADN.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos

Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Precipitación de ADN
• El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol

absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos nucleicos son

insolubles en soluciones alcohólicas.
• Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la

precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa, mientras

que con isopropanol (IprOH) se demanda solamente 0.7 veces el
volumen de fase acuosa.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Precipitación de ADN
• Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes

monovalentes (K+, Na+, NH4+) a la solución de ácidos nucleicos

cargados negativamente, con el fin de generar sales insolubles en
alcohol de fácil precipitación.
• La precipitación se favorece incubando a bajas temperaturas (–

20°C); una centrifugación posterior permite la obtención de una

pastilla o botón del ácido nucleico en el fondo del tubo, al decantar el
alcohol.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Lavado del ADN

• El botón de ADN obtenido en la precipitación se lava con

etanol al 70% por, al menos, dos ocasiones. El contenido

de alcohol de esta solución (70%) mantiene al ADN
precipitado, y el H2O (30%) permite la disolución de las
sales presentes. Después de los lavados, se seca el
botón, lo que permite la evaporación del alcohol
(espontánea o acelerada en un desecador).
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Disolución del ADN y adición de ARNsa

• Inmediatamente después de la evaporación del alcohol, el botón de

ADN se disuelve en soluciones que aseguren su preservación, como

agua estéril y libre de ADNasas, o bien soluciones amortiguadoras,
como el buffer Tris EDTA.
• La cantidad de solución para disolver el ADN debe ser mínima para

mantener una concentración adecuada del ácido nucleico que

permita su empleo en técnicas posteriores, pero suficiente para
lograr una disolución total del ADN.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo
Disolución del ADN y adición de ARNsa
• El ADN se disuelve por pipeteo constante del botón hasta lograr una solución

homogénea. Los estudios indican que la disolución del ADN en buffer TE

preserva por mayor tiempo y en mejores condiciones que cuando se disuelve
en agua estéril;
• El ARN se disuelve en agua-dietil pirocarbonato (DEPC) al 0.1%, lo que evita

cualquier interferencia de las sales de las soluciones amortiguadoras y lo

preserva de las ARNsas.
• Para eliminar el ARN contaminante proveniente de la extracción, la solución

de ADN se incuba por una hora a 37°C con ARNsas para, así, evitar que el
ARN interfiera en la cuantificación y en posteriores técnicas.
Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo

Disolución del ADN y adición de ARNsa

• Para eliminar el ARN contaminante proveniente de la extracción, la

solución de ADN se incuba por una hora a 37°C con ARNsas para,
así, evitar que el ARN interfiera en la cuantificación y en posteriores
técnicas.
• Los métodos de purificación de ácidos nucleicos combinan

estrategias tan diversas como la extracción/precipitación, la

cromatografía, la centrifugación, la electroforesis y la separación por
afinidad.
2.3- Extracción de cadenas nucleotídicas.

• ¿Qué tipo de DNA extraemos con este

procedimiento?
• ¿Qué experimentos podemos plantear?
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

• Existe más de un método de cuantificación de

ácidos nucleicos; ¿Cuáles son?

2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

• Existe más de un método de cuantificación de

ácidos nucleicos; los más usados son:

• La espectrofotometría

• La fluorometría.
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Espectrofotometría
• El fundamento de la espectrofotometría es que cualquier

solución que contenga moléculas suspendidas permite

el paso de un haz de luz a través de ella en proporción
inversa a la cantidad de moléculas que contiene.
• Los nucleótidos de ADN y ARN presentan la absorción

máxima a una longitud de onda de 260 nm (luz

ultravioleta, UV).
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Espectrofotometría
• En la celda del espectrofotómetro un haz de luz

atraviesa la solución de ácidos nucleicos y, cuando

ha pasado por la muestra, un fotodetector mide la
intensidad de luz absorbida. Mientras más luz
absorba la muestra (absorbancia) mayor será la
concentración de ácidos nucleicos.
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Espectrofotometría
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Espectrofotometría

• Se requieren volúmenes relativamente grandes de solución para cubrir

la capacidad de las celdas de los espectrofotómetros, suelen

manejarse diluciones 1:100 a 1:1000 del stock de ADN, en una

solución en fosfato de sodio dibásico, 1.5 μM a pH 5.2 (Na2HPO4).

• Algunos equipos permiten la lectura directa del ácido nucleico, como el

espectrofotómetro NanoDrop™, usando volúmenes micrométricos (1 a

2 µM), donde la muestra no se diluye sino que se aplica directamente

en el aparato.
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Espectrofotometría

• ¿Cómo funciona el nanodrop?

• ¿Qué lo convierte en un equipo muy

conveniente?

• ¿Qué datos nos aporta?

2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.
Espectrofotometría
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Espectrofotometría
• A pesar de que la técnica de extracción de ácidos nucleicos esté bien

realizada, es prácticamente imposible eliminar la totalidad de las

proteínas celulares que acompañan al ADN, así como solventes u

otros componentes orgánicos empleados en la extracción, los cuales

se presentan como contaminantes de la solución de ácido nucleico.

2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Espectrofotometría
• Debido a que el espectro de absorción de luz de estas moléculas es

característico, la absorción en otras longitudes de onda de la

muestra de ácidos nucleicos se compara con la absorción a 260 nm,

con el fin de valorar la pureza del ácido nucleico extraído. Así, para el

cálculo de estos índices se procede a dividir la OD obtenida para la

muestra de ácidos nucleicos a 260 nm entre la OD de interés.

2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Contaminación con proteínas: índice 260 ÷ 280

• Dado que las proteínas (en particular los aminoácidos

aromáticos) absorben luz a una longitud de onda de

280 nm, por lo común el índice de absorción 260÷280

nm se utiliza para valorar la pureza de los ácidos

nucleicos con respecto a la contaminación con

proteínas.
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Contaminación con proteínas: índice 260 ÷ 280

• Cuando éste se encuentra entre 1.8 y 2.0, se considera

óptimo, ya que valores cercanos a 1.8 indican que la muestra

contiene casi exclusivamente ADN; para el ARN el índice

óptimo es de 2.0. La presencia de proteínas hará disminuir

este cociente, por lo que si la relación 260÷280 es menor que

1.8 la cantidad de proteína en la muestra es alta y es

conveniente realizar un nuevo proceso de extracción.

2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Contaminación con proteínas: índice 260 ÷ 280

• Un índice mayor que valores de 2.0 indica una rotura de las

cadenas de los ácidos nucleicos, y se considera que es un ácido

nucleico de calidad insuficiente, por lo que en este caso también

se recomienda una nueva extracción. Sin embargo, este índice

no es infalible y puede modificarse si el pH del medio se

modifica; la acidez puede hacer disminuir hasta 0.2 a 0.3

unidades el índice, mientras que la basicidad puede aumentarlo.

2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Contaminación con proteínas: índice 260 ÷ 280

• Por otro lado, la composición de nucleótidos afecta también

esta relación, ya que si se calculase el índice 260÷280 para

cada nucleótido se obtendría: guanina: 1.15, adenina: 4.50,

citosina: 1.51, uracilo: 4.00 y timina: 1.47; por ello, el ARN

tendrá típicamente valores mayores que el índice 260÷280,

por su contenido de uracilos, que difieren notablemente del

índice que producen las timinas.

2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Contaminación con fenol: índice 260 ÷ 270

• El fenol tiene un pico de absorbancia de 270 nm, por lo que

a 260 nm todavía absorbe gran cantidad de luz. Debido a

este efecto solapante, la contaminación con fenol (utilizado
en la extracción) sobreestima de forma significativa la
concentración de ácidos nucleicos. Las preparaciones de
ácidos nucleicos sin contaminación fenólica presentan un
índice 260÷270 de alrededor de 1.2.
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Contaminación con fenol y sales: índice 260 ÷ 230

• La absorción de luz UV a una longitud de onda de 230

nm significa que la muestra está contaminada con iones

fenolatos o tiocianatos, péptidos, compuestos aromáticos
u otras sustancias.
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.

Contaminación con fenol y sales: índice 260 ÷ 230

• Para muestras puras de ácidos nucleicos el índice

260÷230 se espera en el rango 2.0-2.2; muestras con un

índice menor indican la presencia de contaminantes que
absorben a 230 nm, como EDTA, carbohidratos y fenol.
2.4- Contaminantes en la preparación y extracción de
muestras.
• Contaminación con proteínas: índice 260 ÷ 280: Cuando

éste se encuentra entre 1.8 y 2.0, se considera óptimo.

• Contaminación con fenol: índice 260 ÷ 270: El índice

260÷270 debe estar alrededor de 1.2.

• Contaminación con fenol y sales: índice 260 ÷ 230: El

índice 260÷230 se espera en el rango 2.0-2.2.

2.5- Registro, etiquetado y conservación de los
productos extraídos hasta su análisis
• Identificar cada alícuota para su almacenaje, con:

• El tipo de muestra

• Un código de identificación (predeterminado por centro y serie clínica)

• La fecha de extracción

• La fecha de nacimiento del paciente

• Se recomienda emplear una etiquetadora tipo LABPAL

(MARCA Brady) y cubrir la etiqueta con cinta adhesiva de

celofán, para evitar que se deteriore durante el
almacenamiento.
2.5- Registro, etiquetado y conservación de los
productos extraídos hasta su análisis

• El etiquetado tiene como objetivo asegurar de forma

inequívoca la procedencia y las características

específicas de cada una de ellas.
• Se busca controlar al máximo los posibles errores o la

ambigüedad en la identificación, o incluso evitar la

necesidad de realizar procedimientos adicionales sobre la
muestra para conocer algunas de sus características que
han sido previamente exploradas
2.5- Registro, etiquetado y conservación de los
productos extraídos hasta su análisis

• Aunque existen varios sistemas de etiquetado, el más

recomendable emplea códigos de barras/puntos. Otras

posibilidades incluyen escritura con tinta indeleble o
contenedores (por ejemplo, tubos) que tienen grabados
sistemas de barras/puntos. Cualquiera que sea el sistema
empleado es recomendable que se cumplan los
siguientes requisitos:
2.5- Registro, etiquetado y conservación de los
productos extraídos hasta su análisis

• Evitar el deterioro de la etiqueta y de la información

contenida en ella con el tiempo y la temperatura extrema.

• Generar un número o cadena alfanumérica que sirva de

identificador único de dicha muestra, sea cual sea la base

de datos en la que ésta figure.
• Su lectura debe ser inequívoca y sin ambigüedades, y

permitir la rápida identificación de la muestra.

2.5- Registro, etiquetado y conservación de los
productos extraídos hasta su análisis

• Se ha de colocar en un sitio visible y de fácil acceso en el

contenedor de la muestra, e incluir sin problemas de

espacio todo el código identificador.
• No debe contener datos confidenciales directa o

fácilmente identificables. Por ejemplo, DNI.

• El sistema de etiquetado debe estar ligado a todos los

datos técnicos de procesamiento en la base de datos del

biobanco (Registro).
2.5- Registro, etiquetado y conservación de los
productos extraídos hasta su análisis

• Según estas premisas, los sistemas de etiquetado con

códigos de barras/puntos son en principio

recomendables, ya que además garantizan una gran
rapidez en el etiquetado, una identificación rápida e
inequívoca de la muestra.
• De cualquier manera, es importante seleccionar un tipo

de pegatina que no corra el riesgo de despegarse y/o

borrarse total o parcialmente.
2.5- Registro, etiquetado y conservación de los
productos extraídos hasta su análisis

• Guardar las muestras inmediatamente después del

alicuotado y etiquetado, en un congelador a -80 ºC.

• Registrar la muestra en la base de datos prevista con los

datos del apartado anterior y con los datos de

identificación del paciente (los datos del paciente no
deben salir del centro).