TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN EN
FRESCO.
COLORANTES Y TINCIONES
1.- Introducción.
2.- Técnicas de observación de gérmenes vivos.
3.- Colorantes biológicos:
4.- Tinciones:
5.1.- Técnica general de la tinción.
5.2.- Tinciones más frecuentes en bacteriología:
5.2.1.- Tinción simple.
5.2.2.- Tinciones diferenciales :
A) Tinción de Gram.
B) Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes.
5.2.3.- Tinciones estructurales:
1) Tinción de cápsulas.
2) Tinción de esporas.
3) Tinción de flagelos.
5.2.4.- Otras tinciones:
5.- Movilidad bacteriana. Métodos de estudio.
1.- Introducción.
Características Presencia de
tintoriales microorganismos
EXAMEN
MICROSCÓPICO
Estructuras
externas e internas Morfología
Movilidad
1.- Introducción.
La mayoría de las observaciones en
Microbiología Clínica, excepto en virología, se
realizan con el microscopio óptico de campo
luminoso.
El examen microscópico comporta habitualmente
dos modalidades diferentes:
* examen "in vivo"
* mediante tinción
Dado el tamaño de las bacterias y su índice de refracción, cercano al del agua, existe una
falta de contraste que hace difícil su observación y por eso se requiere generalmente el empleo
de colorantes para una visualización adecuada
1.- Introducción.
El examen microscópico comporta dos modalidades:
1ª) Observación “in vivo” o en fresco
La ventaja de esta técnica es la observación de la morfología más fiel a la realidad y la
motilidad
Los inconvenientes estriban en el poco contraste . Las preparaciones no se puede
conservar
2ª) Frotis o extensión desecada, fijada y teñida mediante uno o varios colorantes
Es la técnica más empleada para la observación de la morfología y agrupación,
diferenciar unas bacterias de otras (tinciones diferenciales) o poner de manifiesto
determinadas estructuras (tinciones estructurales).
Las preparaciones se pueden conservar durante largo tiempo utilizando un medio de
montaje y colocándoles un cubre.
1.- Introducción.
2.- Técnicas de observación de gérmenes vivos.
3.- Colorantes biológicos:
4.- Tinciones:
5.1.- Técnica general de la tinción.
5.2.- Tinciones más frecuentes en bacteriología:
5.2.1.- Tinción simple.
5.2.2.- Tinciones diferenciales :
A) Tinción de Gram.
B) Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes.
5.2.3.- Tinciones estructurales:
1) Tinción de cápsulas.
2) Tinción de esporas.
3) Tinción de flagelos.
5.2.4.- Otras tinciones:
5.- Movilidad bacteriana. Métodos de estudio.
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
Para la observación de gérmenes vivos se puede partir:
* de las muestras patológicas, secreciones, etc. que los contengan
* de cultivos de estos gérmenes en medios líquidos o sólidos.
El examen en fresco se dirige principalmente a :
• Detección de bacterias directamente en las muestras
• Cuantificar su concentración
• Obtener alguna información sobre su morfología,
tamaño, modo de agrupación y, con frecuencia
• Determinar la movilidad de una especie aislada. Al final de este tema veremos las
distintas técnicas que se pueden utilizar en el estudio de la movilidad bacteriana
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
La técnica más habitual es:
a) Montaje húmedo:
Consiste en la observación entre porta y cubre de una suspensión
bacteriana o muestra.
Para examinar un cultivo en caldo o muestra líquida se coloca una
gota con asa de siembra o pipeta de Pasteur en el centro de un porta
limpio y desengrasado.
Posteriormente situamos el cubre
encima procurando que no queden
burbujas.
Para ello se coloca se coloca un borde del cubre sobre el pota con un ángulo de 45º, se
aproxima a la gota, esperamos a que se extienda por el borde y soltamos dejando caer el cubre
con cuidado. Presionamos ligeramente para que contacten bien ambos cristales
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
a) Montaje húmedo:
Siempre que se utilice el microscopio ordinario en la observación de suspensiones
acuosas, el condensador debe estar bajo, el diafragma semicerrado y la iluminación reducida
para incrementar el contraste.
Se empieza con objetivo seco fuerte y después se puede pasar a objetivo de inmersión.
Si partimos de una colonia sobre medio
en placa o muestra sólida (heces por
ejemplo), se pone una gota de solución salina
fisiológica o agua destilada sobre el porta y
en ella suspendemos un asa de la colonia o
de la muestra. Después colocar el cubre
evitando burbujas y observar
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
b) Técnicas microscópicas especiales
La microscopía de contraste de fases y la microscopía de campo oscuro ofrecen ventajas
indiscutibles para la observación de preparaciones sin teñir.
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
Se observa muy bien la movilidad de un microorganismo,
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
La microscopía de campo oscuro
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
A. Campo luminoso, B. Campo oscuro, C y D. Contraste de fases.
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
c) Coloración vital
Consiste en la utilización de colorantes muy poco tóxicos y a diluciones muy altas de
forma que se tiñan ligeramente las bacterias sin que se produzca la muerte de las mismas.
Para ello se realiza el montaje mezclando la muestra con el colorante diluido en
solución acuosa sobre un portaobjetos, colocando un cubreobjetos y observando al
microscopio.
Entre los más empleados tenemos
azul de metileno en solución acuosa al
1/500 o 1/1000 y rojo neutro en
solución acuosa al 1/1000
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
d) Preparaciones en fresco con KOH al 10 – 30 %
Se realiza la técnica igual que la anterior, pero empleando como líquido para la
suspensión esta solución, que aumenta la refringencia y esponja las estructuras fúngicas.
Si en la preparación hay también bacterias, disminuye su vitalidad.
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
e) Contraste negativo
Se trata de un montaje con nigrosina en solución acuosa al 1 %, o tinta china. Las
bacterias no toman estos colorantes, pero resaltan más sobre el fondo oscuro que
proporcionan.
Es muy útil para observar morfología y
sobre todo para estudio de Cryptococcus
neoformans en LCR
2.- TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE GÉRMENES VIVOS
f) Gota pendiente
Es el mejor método para el estudio de la motilidad debido al grosor de la gota y además
se deseca menos.
Se necesita un portaobjetos especial, denominado portaobjetos excavado o de Koch
1.- Introducción.
2.- Técnicas de observación de gérmenes vivos.
3.- Colorantes biológicos:
4.- Tinciones:
5.1.- Técnica general de la tinción.
5.2.- Tinciones más frecuentes en bacteriología:
5.2.1.- Tinción simple.
5.2.2.- Tinciones diferenciales :
A) Tinción de Gram.
B) Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes.
5.2.3.- Tinciones estructurales:
1) Tinción de cápsulas.
2) Tinción de esporas.
3) Tinción de flagelos.
5.2.4.- Otras tinciones:
5.- Movilidad bacteriana. Métodos de estudio.
3.- COLORANTES BIOLÓGICOS
COLORACIÓN O TINCIÓN
Es un proceso mediante el cual un elemento toma color bajo la acción de una sustancia
colorante
COLORANTE
Una sustancia capaz de comunicar su color a otros cuerpos
Los colorantes biológicos suelen ser compuestos orgánicos, un tanto complejos en
cuanto a su estructura molecular. Muchos derivan del grupo benceno
Los colorantes pueden emplearse para:
* Teñir estructuras biológicas.
* Como indicadores de pH en los medios de cultivo.
• * Como indicadores de oxido reducción en medios de cultivo anaerobio.
* Para inhibir selectivamente a ciertas bacterias.
3.- COLORANTES BIOLÓGICOS
Clasificación de los colorantes
1) Colorantes básicos o catiónicos:
Presentan afinidad por estructuras de carácter ácido como el material
nuclear celular (rico en ADN); son colorantes nucleares: son los más
empleados en Microbiología.
Ejemplos: azul de metileno, cristal de violeta, violeta de genciana,
safranina, fucsina básica, ...
Además, dado que las envueltas externas de los microorganismos
están por lo general cargadas negativamente, estos colorantes se
combinan con estructuras de la superficie celular, y son, por lo tanto,
excelentes colorantes de aplicación general
3.- COLORANTES BIOLÓGICOS Clasificación de los colorantes
2) Colorantes ácidos o aniónicos
Presentan afinidad por estructuras de carácter básico; tiñen bien
los citoplasmas celulares por su alto contenido en proteínas.
Ejemplos: Fucsina ácida, Rojo Congo, Ácido pícrico, Eosina, ..
3) Colorantes neutros:
Son sales de un colorante ácido con otro básico, en los que el ácido y la base son
coloreados y la sal resultante de la unión de ambos comparte sus propiedades. Son capaces de
teñir tanto estructuras ácidas como básicas.
Son muy empleados en hematología.
Ejemplos: Giemsa, Eosinato de azul de metileno, Wright,...
3.- COLORANTES BIOLÓGICOS Clasificación de los colorantes
4) Colorantes indiferentes:
Existen colorantes que carecen de grupos capaces de formar sales,
son liposolubles, por lo que tiñen bien las inclusiones celulares de
contenido graso.
Ejemplos: Sudán III, Negro Sudán, Rojo escarlata
En Bacteriología se usan sobre todo los colorantes artificiales básicos ya que el material
nuclear de las bacterias, de carácter ácido, parece tener una distribución uniforme por
toda la célula
En algunas tinciones es necesario el empleo de un “mordiente” que es una sustancia que
no tiene color en si misma pero que permite reforzar la unión del colorante y la estructura
o la facilita, por ejemplo el lugol
Cuando un colorante se une a una determinada estructura, ésta ya no puede ser
teñida por otro, salvo que pierda el color por una decoloración química
3.- COLORANTES BIOLÓGICOS
Preparación de soluciones de colorantes
1.- Pesar exactamente la cantidad de colorante (en polvo) calculada y ponerla en un mortero.
Triturar si hace falta
3.- COLORANTES BIOLÓGICOS Preparación de colorantes
2.- Añadir el diluyente poco a poco hasta agregarlo casi
todo. El primer diluyente será el alcohol. Luego se
añaden los demás.
3.- Echarlo en un matraz erlenmeyer o en un frasco, lavando el material de pesada y
mortero con un resto de diluyente (guardar un poco)
3.- COLORANTES BIOLÓGICOS
Preparación de colorantes
4.- Dejarlo en reposo durante 24 horas (al abrigo de la luz) y luego filtrar sobre un frasco
color topacio. Anotar en la etiqueta la composición y la fecha de preparación.
1.- Introducción.
2.- Técnicas de observación de gérmenes vivos.
3.- Colorantes biológicos:
4.- Tinciones:
5.1.- Técnica general de la tinción.
5.2.- Tinciones más frecuentes en bacteriología:
5.2.1.- Tinción simple.
5.2.2.- Tinciones diferenciales :
A) Tinción de Gram.
B) Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes.
5.2.3.- Tinciones estructurales:
1) Tinción de cápsulas.
2) Tinción de esporas.
3) Tinción de flagelos.
5.2.4.- Otras tinciones:
5.- Movilidad bacteriana. Métodos de estudio.
4.- TINCIONES
Debido a que las bacterias son muy pequeñas y poseen un protoplasma con un índice de
refracción cercano al del agua, las tinciones van a favorecer su visualización y a permitir
demostrar la existencia de determinadas estructuras.
Las tinciones alteran a los
microorganismos, por lo que habrá una
diferencia sustancial respecto a lo que sería la
observación de células y estructuras vivas. Se
utilizarán técnicas que minimicen estas
diferencias
4.- TINCIONES
Técnica general de la tinción
Se utilizarán portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados
1º.- Extensión o preparación del frotis
Cuando el producto a teñir es líquido se depositará con asa de inoculación,
previamente flameada (si es metálica) y enfriada (para evitar la formación de aerosoles), una
gota del mismo sobre el portaobjetos y se extenderá formando una capa fina y uniforme de
aproximadamente 1,5 cm. de lado.
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
1º.- Extensión o preparación del frotis
Cuando se parte de un producto sólido o semisólido se depositará una gota de agua
destilada o SSF en el porta y, utilizando asa de inoculación, previamente flameada, se
suspenderá en ella una pequeña cantidad de cultivo o producto. Se extiende de la misma
forma que en el caso anterior
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
1º.- Extensión o preparación del frotis
En caso de exudados, si tenemos varios hisopos de la misma muestra, se puede realizar
la extensión con uno de ellos, bien directamente o introduciéndolo previamente en un tubo
con 1 ml. de solución salina fisiológica estéril y escurriendo el exceso en la pared del mismo.
También se puede tomar una gota de esta suspensión, depositarla en el centro del
portaobjetos y extenderla
En general hay que procurar no poner demasiada masa pues se formaría una capa
gruesa que dificultaría la observación; la extensión debe quedar lo más fina y homogénea
posible (que se pueda leer a través de ella cuando esté seca).
En caso de muestra de esputo baciloscópico es mejor una extensión más gruesa y que
ocupe 2/3 del porta (el número de bacilos A.A.R. puede ser muy bajo).
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
2º.- Desecación
Se deja secar la extensión a temperatura ambiente o por calentamiento suave sobre el
mechero, manteniendo el portaobjetos alto por encima de la llama.
Existen unas planchas metálicas que se calientan y se depositan sobre ellas los
portaobjetos para acelerar la desecación.
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
3º.- Fijación
El objetivo de la fijación es adherir la preparación al porta, manteniendo la morfología
bacteriana, por coagulación rápida de las proteínas, en caso de fijación por calor y también
inactivar a los patógenos.
A partir de la fijación, las bacterias son inviables
La fijación puede realizarse:
a) Por calor:
Pasando el porta 2 ó 3 veces por la llama del
mechero con la cara de la preparación hacia arriba, sin
sobrecalentar. El portaobjetos debe notarse caliente
pero no quemar cuando se coloca en el dorso de la
mano.
El calor es el agente fijador más utilizado en
Microbiología.
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
3º.- Fijación
b) Con metanol:
Se cubre con metanol 30 segundos si la extensión es fina y 1 minuto si es gruesa
(esputo o frotis grueso). Actúa fijando por su avidez por el agua .
La fijación química se prefiere cuando se sospecha de gérmenes que se
transmiten por inhalación y para la observación de cápsulas ya que estas se alteran por el
calor.
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
4º.- Enfriar
En caso de fijación por calor es necesario
este paso porque algunos colorantes precipitan o
cristalizan sobre las estructuras.
Si se ha fijado con alcohol es necesario
esperar a que se seque una vez retirado el
exceso
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
5º.- Coloración o Tinción
La preparación se expone a uno o dos colorantes según sea la tinción simple o doble. El
primer colorante se denomina colorante principal y el segundo, contracolorante o
colorante de contraste
Los tiempos de coloración son orientativos, la práctica nos dirá si hay que alargarlos o
acortarlos
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
6º.- Lavado
Se realiza con agua destilada, procurando que el chorro no incida en la preparación.
Se realiza hasta que el efluente salga claro.
Si empleamos agua del grifo, el color va a cambiar un poco debido al cambio de pH
(cloro y otras sustancias) y puede precipitar cal en la preparación
4.- TINCIONES Técnica general de la tinción
7º.- Secado
Es imprescindible ya que tras localizar una zona propicia con objetivo seco, la
observación se realiza con aceite de inmersión.
El secado se puede realizar en dos fases:
* Secado “grosero”, entre papel de filtro, sin presionar directamente sobre la
extensión.
* Secado “fino”: se puede dejar la extensión a temperatura ambiente o bien sobre el
mechero de forma similar al secado previo a la fijación
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES
1.- Tinciones simples o sencillas
En ellas interviene un solo colorante. Permiten información sobre la forma, agrupación y
cantidad de gérmenes.
Ejemplo: tinción con azul de metileno de Loeffler
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES
2.- Tinciones diferenciales:
Se utilizan 2 colorantes, de modo que, dependiendo del tipo de microorganismo que se
trate, quedará teñido por uno u otro.
Ejemplo: tinción de Gram, tinción AAR
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES
3.- Tinciones estructurales:
Se usan colorantes concretos que ponen de manifiesto estructuras que unos microorganismos
poseen y otros no, sirviendo para diferenciarlos.
Ejemplo: tinción de cápsulas, esporas, flagelos, etc..
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES
4.- Otras tinciones:
Ejemplo: de gránulos metacromáticos, de gránulos de poli – Beta – hidroxibutirato, de
gránulos de carbohidratos.
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES
TINCIÓN SENCILLA
Permiten información sobre la forma, agrupación y cantidad de gérmenes
Como colorante se usa habitualmente el azul de metileno de Loeffler, aunque se puede
usar cualquier otro como la safranina, fucsina etc.
Técnica:
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES TINCIÓN SENCILLA
Azul de metileno,
Cristal Violeta,
Fucsina básica diluida,
2’ Safranina
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES TINCIÓN SENCILLA
Observación Se usará el microscopio con el objetivo x100
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES TINCIÓN SENCILLA
Las bacterias aparecerán teñidas del color del colorante empleado.
Algunos géneros como Corynebacterium y Lactobacillus presentan gránulos de
polifosfatos con mayor apetencia por el azul de metileno de Loeffler
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES
TINCIONES DIFERENCIALES
Se fundamentan en las diferencias físico-químicas que existen en las estructuras externas
de las bacterias, las cuales serán las causantes de que estas respondan de forma distinta
frente a la coloración.
En ellas se utiliza más de un colorante a fin de diferenciar grupos bacterianos. Esto
ayuda a la clasificación taxonómica
A) Tinción de Gram.
B) Tinciones de ácido-alcohol resistencia
B.1.- Tinción de Ziehl-Neelsen
B.2.- Tinción de Kinyoun
B.3.- Tinción con colorantes fluorescentes
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES TINCIONES DIFERENCIALES
TINCIÓN DE GRAM
Se estudia con esta coloración:
* La morfología de las bacterias
* Su agrupación
Gram +
* Su taxonomía. Gram -
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
La diferencia de comportamiento ante los colorantes reside en la composición de la
pared celular.
Pared Gram - Pared Gram +
• Contiene menor cantidad • Es más gruesa
de mureina
• Posee una malla bien
• Es más laxa engarzada
• Posee un % alto de lípidos • Presenta más mureina y menor
(hasta un 22%) proporción de lípidos (1-4 %)
El tratamiento con alcohol-acetona
disuelve los lípidos
En esta tinción se usará un mordiente, el lugol, que aumentará la fijación del primer
colorante a la bacteria.
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
TÉCNICA:
1.- Seleccionar la colonia a teñir
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
2.- Hacer el frotis
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
3. Añadir Cristal violeta 4. Tirar el Cristal violeta y
(1º colorante) lavar con agua (opcional)
1,5 minutos
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
5. Añadir Lugol 6. Tirar el lugol y añadir
(Mordiente) Alcohol-acetona
(Decolorante)
MUY IMPORTANTE
Lavar rápidamente con
agua para cortar la
decoloración
Pocos segundos
1,5 minutos
(10 – 15)
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
7. Añadir Safranina 8. Tirar la Safranina y
(2º colorante) lavar con agua
1,5 minutos
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
9. Secar al aire 10. Colocar una gota
o con papel de filtro de aceite de inmersión
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
11. Observación al microscopio con el objetivo x100
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
. Se conocen otros dos grupos :
* las Gram variables y
* las Gram no reactivas.
Las variables pueden ser + o - indistintamente. Por ejemplo algunas especies del
género Neisseria.
Las no reactivas incluyen géneros que no se tiñen bien o lo hacen con deficiencia, como
es el caso de Mycobacterium y muchas espiroquetas
Esta tinción es aplicable a levaduras, siendo la mayoría gram positivas. No se emplea este
método para otros microorganismos como los protozoos y hongos que no sean levaduriformes
Los cultivos bacterianos envejecidos pueden dar resultados dudosos por el deterioro de las
paredes celulares. Se recomienda realizar la tinción de Gram a cultivos de 24 horas
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
Fuentes de error
• Exceso de tiempo en la decoloración.
• Precipitación del colorante en forma de agujas, por exceso de calor del portaobjetos
antes de su adición
• Contaminación bacteriana de los reactivos.
• Artificios coloreados procedentes de la muestra o de suciedad del portaobjetos
• Mala técnica de coloración.
• Las bacterias G (+) viejas, muertas o en contacto con antimicrobianos, pueden aparecer
como G (-) por alteración de sus propiedades físicas y químicas.
• Hay bacterias G (+) que pierden el colorante con facilidad y pueden aparecer G -
• Las bacterias que se tiñen débilmente pueden pasar desapercibidas.
• Hay microorganismos que no se tiñen con esta tinción
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
Pseudomonas Klebsiella
Streptococcus
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIÓN DE GRAM
TINCIONES DIFERENCIALES
TINCIONES DE ÁCIDO ALCOHOL RESISTENCIA (A.A.R.)
Tienen como objetivo el diferenciar bacterias capaces de resistir la decoloración con
alcohol y ácido (bacterias ácido-alcohol resistentes = AAR).
Se emplean principalmente para el
diagnóstico de enfermedades producidas por
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium
leprae.
Las micobacterias tienen forma de
bastoncitos finos rectos o curvados, de 1 a 10
micras, suelen presentarse aisladas o en grupos
con formas diversas
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Criptosporidium
Nocardia
Bacillus cereus
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Se fundamentan en que existen determinados grupos bacterianos difíciles de teñir con
los colorantes habituales debido a la gran cantidad de sustancias céreas y lipídicas (ácido
micólico) que poseen en su pared.
Para teñirlos hay que forzar la coloración mediante:
* Aplicación de calor junto a fucsina básica concentrada
• Utilización de una mayor concentración de fenol y colorante en la solución colorante
• Por un contacto prolongado del frotis con el colorante
• Mediante la adición al colorante de agentes humectantes: se sustituye el calor por un
tratamiento con detergente (tergitol) incorporado al colorante
Una vez que se han teñido retienen el colorante tan fuertemente que incluso decolorando
con una solución alcohólica acidulada (alcohol-ácido, decolorante muy enérgico) no se
consigue eliminar el colorante
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Tinción de Ziehl-Neelsen
Esta tinción se basa en solubilidades selectivas:
1.- La fucsina es más soluble en fenol que en agua o ácido alcohol;
2.- A su vez el fenol es más soluble en ceras o lípidos, tales como los presentes
en el bacilo tuberculoso, que en agua.
3.- Durante la tinción, el fenol-fucsina penetra en los lípidos y permanece en la
pared porque es más soluble en ellos que en el agente decolorante. El calor va a
actuar como mordiente.
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
TÉCNICA:
1.- Seleccionar la colonia a teñir
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
2.- Hacer el frotis
Esputo
1 minuto
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
3. Cubrir con fuscina
fenicada (1º colorante) 4.- Se deja enfriar y se lava
abundantemente
Dejando actuar 1’ en frio
y 5´ tras la emisión de
vapores
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
5.- Decolorar con alcohol-clorhídrico hasta que la preparación quede con un ligero
tinte rosa
6.- Lavar para cortar la
decoloración
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
7. Añadir el colorante de contraste(2º colorante)
Azul de metileno,
2 minutos Verde brillante
Verde malaquita
8. Lavar y secar
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
9. Secar al aire 10. Colocar una gota
o con papel de filtro de aceite de inmersión
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
11. Observación al microscopio con el objetivo x100
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R. Tinción de Ziehl-Neelsen
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Tinción de Kinyoun
Es una tinción de ácido-alcohol resistencia, modificación de la tinción de Ziehl-
Neelsen, llamada también método frío debido a que en lugar de emplear calor para facilitar
la penetración del colorante se aumenta la proporción de fenol y fucsina en la fórmula
del colorante respecto con respecto a la fucsina de Ziehl.
La técnica es igual a la de Ziehl con las siguientes diferencias:
* No se aplica calor.
* El tiempo de actuación de la fucsina es de unos 7 minutos
Las coloraciones de los AAR son más débiles por esta técnica.
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Tinción con colorantes fluorescentes
El objetivo es también detectar micobacterias en muestras con escasos número de
bacilos, de manera más rápida y cómoda que con la tinción de Ziehl
Se fundamenta en que los colorantes
fluorescentes o fluorocromos, como por
ejemplo Auramina, Naranja de acridina y
rodamina, presentan una apetencia selectiva por
el ácido micólico, por lo que se fijan sobre las
micobacterias de tal manera que al incidir la
luz ultravioleta sobre ellas se emite una luz
visible fluorescente.
Se emplea como colorante de contraste permanganato potásico que proporciona un
fondo oscuro
TINCIONES A.A.R. Tinción con colorantes fluorescentes
Presentan además la ventaja de que permiten realizar sobre ellas, posteriormente, la
tinción de Ziehl o Kinyoun, por si se quiere confirmar un resultado
Técnica
1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar
4. Cubrir con auramina – O durante 15 minutos
5. Lavar con agua destilada
6. Decolorar con alcohol-clorhídrico hasta eliminar el colorante
7. Lavar para cortar la decoloración
8. Cubrir con Permanganato potásico durante 2 – 3 minutos
9. Lavar.
10. Secar y observar al microscopio de fluorescencia 20 x y 40 x
TINCIONES A.A.R. Tinción con colorantes fluorescentes
La interpretación es que los bacilos tuberculosos y otras micobacterias se observan amarillo
dorado sobre fondo oscuro.
TINCIONES A.A.R. Tinción con colorantes fluorescentes
Ventajas de la tinción de fluorescencia:
* Fácil, rápida y completa observación por el contraste entre las micobacterias
coloreadas brillantemente y el fondo oscuro.
* Puede usarse un objetivo 25X para observar el frotis, lo que permite la inspección de
un área extensa en poco tiempo.
* Mínimo esfuerzo visual y la relativa falta de agudeza visual para el color del
observador.
Estas técnicas están recomendadas para los laboratorios con un gran número de
muestras
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Lectura y expresión de los resultados
-Examinar en un microscopio (luz visible) con un objetivo de inmersión ( x 100) con
aceite
- La búsqueda de bacilos AAR debe ser exhaustiva a lo largo de toda la extensión del
frotis, e incluso conviene examinar dos frotis de la muestra, porque a veces hay muy pocos
bacilos tuberculosos en la muestra. Se debe examinar un mínimo de 300 campos antes de dar
una tinción como negativa.
- Se procurará seguir un orden dentro del portaobjetos (izquierda a derecha, zig-zag,
etc.) iniciando la observación por un extremo del mismo
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Lectura y expresión de los resultados
El resultado suele expresarse de forma cuantitativa. Hay varias formas de hacerlo:
a) Informando de los bacilos contados por línea del frotis:
* Por una línea del frotis si estos son abundantes. Por ejemplo, 24 BAAR/1L = 24
bacilos de media en cada línea.
* En 2 o 3 líneas si son escasos. Por ejemplo, 10 BAAR/3L .
b) Informando de los bacilos contados por campo o número de campos del frotis:
* Por ejemplo, 5 BAAR/campo, 5 BAAR/100 campos (1 línea = 100 campos en
objetivo de inmersión).
TINCIONES DIFERENCIALES TINCIONES A.A.R.
Lectura y expresión de los resultados
c) Se puede expresar cómo abundantes o escasos BAAR.
d) Se puede expresar en diferentes grados de positividad:
* De 1 a 2 BAAR en toda la extensión (300 campos) no se informará. Realizar una
nueva extensión y tinción o solicitar una nueva muestra.
* De 1 a 9 BAAR en 100 campos, se informará: BAAR +.
* De 1 a 9 BAAR en 10 campos, el informe será: BAAR ++.
* De 1 a 9 BAAR por campo, el informe será: BAAR +++.
* 9 BAAR por campo, deberá informarse: BAAR ++++.
Cuando no se visualiza bacilo alguno en toda la preparación se informará: "No se
observan BAAR“
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES TINCIONES ESTRUCTURALES
Se emplean para poner de manifiesto ciertas estructuras que ayudan a la clasificación
taxonómica de las bacterias
TINCIONES
ESTRUCTURALES
TINCIÓN DE TINCIÓN DE TINCIÓN DE
CÁPSULAS ESPORAS FLAGELOS
Tinción de Anthony
Tinción negativa
TINCIONES ESTRUCTURALES
TINCIÓN DE CÁPSULAS
Tiene como objetivo la visualización de
las cápsulas de bacterias patógenas, tales como
las de Klebsiella pneumoniae, Streptococcus
pneumoniae y Cryptococcus neoformans
Klebsiella pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Cryptococcus neoformans
TINCIONES ESTRUCTURALES TINCIÓN DE CÁPSULAS
La cápsula es una estructura situada alrededor de la
pared de ciertas bacterias. Tiene alto contenido en
carbohidratos que confieren gran resistencia y virulencia a
las bacterias que la poseen.
La cápsula no es una estructura indispensable para la
bacteria, y su producción está influenciada por la
existencia de genes específicos y por factores ambientales
Para estudiar las cápsulas en el laboratorio se deben incubar las bacterias en medios
adecuados que favorezcan su producción. Así por ejemplo se suele recomendar medios con
glucosa o sacarosa como única fuente de carbono para estudiar la producción de cápsula
por Leuconostoc mesenteroides
TINCIONES ESTRUCTURALES TINCIÓN DE CÁPSULAS
No deben fijarse con calor ya que éste las puede alterar al estar formadas por
polímeros de naturaleza polisacarídica o proteica
Tinción de Anthony
Se fundamenta en que las cápsulas, por su
estructura química, no se tiñen normalmente por
colorantes básicos del tipo del cristal violeta o la
safranina.
Al quedar sin teñir y utilizando el sulfato de
cobre para el lavado se les proporciona una
cierta refringencia que favorece su visualización
TINCIÓN DE CÁPSULAS Tinción de Anthony
Técnica
1. Extensión.
2. Desecación.
3. No fijar con calor. Fijación con metanol 30 segundos.
4. Secar
5. Cubrir con colorante: cristal violeta 1’ (tiñe bacterias)
6. Lavar con sulfato de cobre 2 % templado.
7. Dejar actuar el sulfato de cobre durante 45”.
8. Secar y observar. Utilizar cubreobjetos si se va a utilizar objetivo de inmersión.
El resultado es que las bacterias aparecen de color violeta y las cápsulas de color
celeste más refringentes
TINCIONES ESTRUCTURALES TINCIÓN DE CÁPSULAS
Tinción negativa o de Tinta china o Nigrosina
La tinta china está compuesta por
partículas finas de carbón suspendidas en
agua formando un auténtico coloide por lo
que se observan sobre fondo oscuro.
Las partículas son demasiado grandes
para penetrar a través de la matriz de la
cápsula, por lo que sólo se teñirá el medio
circundante.
TINCIÓN DE CÁPSULAS Tinción negativa
Técnica
1. Poner gota de la muestra
2. Añadir una gota de tinta china y mezclar
3. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la mezcla de muestra y tinta china.
Evitar que se formen burbujas
4. Colocar el portobjetos con el cubreobjetos entre dos papeles absorbentes. El exceso
de suspensión será absorbido por los papeles .
5. Tirar el papel a un contenedor para “material contaminado”
6. Observar.
Para distinguir bien la cápsula del resto de la célula se debe aumentar el contraste cerrando
el diafragma del condensador.
La cápsula se verá como un halo transparente alrededor de la célula de color grisáceo
con el medio circundante de color negro.
TINCIONES ESTRUCTURALES
TINCIÓN DE ESPORAS
Algunos microorganismos tienen la propiedad de formar esporas, que son estructuras
fabricadas en el interior de algunas bacterias, las cuales son resistentes al calor,
compuestos químicos, desecación, radiación, ácidos y desinfectantes
TINCIONES ESTRUCTURALES TINCIÓN DE ESPORAS
La pared de las esporas es bastante
impermeable, por lo que cuesta trabajo teñirlas, de
modo que en las preparaciones teñidas por los
métodos corrientes, las esporas aparecen como
cuerpos incoloros y refringentes
Si se fuerza la coloración mediante el calor, el colorante llegará a teñir las esporas
Debido a la citada impermeabilidad de la pared de las esporas, durante el período de
decoloración, se decolorará toda la célula bacteriana excepto las esporas
Se necesitan cultivos de al menos 48 horas, para que el microorganismo haya tenido
tiempo suficiente de formarlas
TINCIÓN DE ESPORAS
TÉCNICA:
1.- Seleccionar la colonia a teñir
TINCIÓN DE ESPORAS
2.- Hacer el frotis
TINCIÓN DE ESPORAS
4.- Coloración: Cubrir la preparación con Verde malaquita al 5% en solución acuosa,
manteniéndola a emisión de vapores durante 5 minutos
Hay que evitar la ebullición del colorante y que en ningún momento la preparación
quede sin colorante
TINCIÓN DE ESPORAS
5.- Dejar enfriar.
6.- Lavar con abundante agua
7.- Añadir el colorante de contraste: Safranina y dejar actuar durante 3 min.
8.- Lavar con agua.
9.- Secar y observar al microscopio
Las esporas se verán de color verde y las células vegetativas se observarán de color
rosa
TINCIÓN DE ESPORAS
Bacillus
TINCIÓN DE ESPORAS
Bacillus
TINCIÓN DE ESPORAS
TINCIONES ESTRUCTURALES
TINCIÓN DE FLAGELOS
Si bien normalmente no es necesario, pueden ser útiles para la identificación de
ciertos bacilos móviles no fermentadores, cuando las reacciones bioquímicas son débiles o
dudosas.
El número de flagelos y su disposición tiene carácter taxonómico.
De las diversas técnicas la de Leifson y las impregnaciones argénticas (Método de
Fleming, de Kirkpatrick y de Fontana Tribondeau) son las más empleadas
TINCIONES ESTRUCTURALES TINCIÓN DE FLAGELOS
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES OTRAS TINCIONES
1) Tinción de gránulos metacromáticos
El género Corynebacterium presenta unos
gránulos de reserva de polifosfatos, llamados
metacromáticos por teñirse de color violeta con
crisoidina en solución acuosa al 1%, siendo el
colorante amarillo.
También pueden visualizarse con Azul de
metileno de Loeffler ya que se tiñen de color más
intenso que el resto de la bacteria
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES OTRAS TINCIONES
2) Tinción de gránulos de poli – Beta – hidroxibutirato
Ciertas bacterias, como Bacillus spp.
presentan estas inclusiones grasas, por lo
que se tiñen bien con negro sudán B
(liposoluble) durante 15´.
Tras lavar con unas gotas de xilol y
posteriormente con agua, se contrasta con
solución acuosa de safranina al 0,5 %.
Las inclusiones de PHB aparecen como
gotitas de color azul y el citoplasma de
color rosa-rojo
4.2.- - TINCIONES MÁS FRECUENTES OTRAS TINCIONES
3) Tinción de gránulos de carbohidratos
Se colorean con cierto tono rojizo con lugol, el resto del citoplasma aparece amarillento.
Se observan bien en levaduras cultivadas en caldo glucosado
1.- Introducción.
2.- Técnicas de observación de gérmenes vivos.
3.- Colorantes biológicos:
4.- Tinciones:
5.1.- Técnica general de la tinción.
5.2.- Tinciones más frecuentes en bacteriología:
5.2.1.- Tinción simple.
5.2.2.- Tinciones diferenciales :
A) Tinción de Gram.
B) Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes.
5.2.3.- Tinciones estructurales:
1) Tinción de cápsulas.
2) Tinción de esporas.
3) Tinción de flagelos.
5.2.4.- Otras tinciones:
5.- Movilidad bacteriana. Métodos de estudio.
MOVILIDAD BACTERIANA. MÉTODOS DE ESTUDIO
La movilidad es una característica importante para la identificación bacteriana, pues
indirectamente señala que el microorganismo posee flagelos, siendo éste un rasgo
taxonómico difícil de poner de manifiesto por otros métodos incluidos los tintoriales
Una bacteria se dice que es móvil cuando
se desplaza en el medio con un gasto de energía
en forma de ATP.
Existe un movimiento browniano de las
bacterias suspendidas en medios líquidos,
debido a su tamaño; éste se realiza sin gasto
energético, pudiendo tratarse de bacterias
inmóviles.
5.- MOVILIDAD BACTERIANA. MÉTODOS DE ESTUDIO
Se pueden distinguir tres tipos de mecanismos de motilidad:
Movimiento por deslizamiento o reptación
Se presenta en superficies de medios sólidos por excreción de sustancias
mucilaginosas. Se mueven las colonias, no las bacterias independientemente. Se conocen
como bacterias limosas.
Movimiento tipo látigo
Se da en las espiroquetas, gracias a una estructura denominada filamento axial
constituido por fibrillas contráctiles que provocan el desplazamiento.
Movimiento de natación gracias a flagelos.
El movimiento flagelar es la transformación de energía química en mecánica,
vinculado metabólicamente con reacciones oxidativas, fermentativas y fosforilación
fotosintética que conduce a la formación de ATP.
5.- MOVILIDAD BACTERIANA. MÉTODOS DE ESTUDIO
Técnicas para demostrar la movilidad bacteriana
En todos los casos tendremos que utilizar para esta prueba cultivos que se encuentren en
fase logarítmica de crecimiento, es decir, cultivos jóvenes
5.1.- Por observación microscópica
5.1.1.- Tinción de flagelos
Técnicas para demostrar la movilidad bacteriana
5.1.- Por observación microscópica
5.1.2.- Montaje húmedo
Especialmente cuando el objetivo es la observación de movilidad NO se debe hacer
una extensión ya que al ser los flagelos muy frágiles se romperían.
Podemos observar tres tipos de movimientos:
P Movimiento de corriente o traslación: debido a la corriente de aire. En preparaciones
selladas será menor.
P Movimiento browniano: es el movimiento que presentan las partículas en suspensión.
Es un movimiento en zig‑zag. Lo presentan todas las bacterias.
P Movimiento bacteriano: es totalmente irregular. Lo presentan solo las bacterias
móviles.
Técnicas para demostrar la movilidad bacteriana
5.1.- Por observación microscópica
5.1.3.- Gota pendiente
Con esta técnica se pueden observar el
movimiento browniano y el bacteriano. El
movimiento de corriente prácticamente no existe
Técnicas para demostrar la movilidad bacteriana
5.2.- Las que se observan por cultivo en medios semisólidos
Los medios de cultivo para la
observación de la movilidad contienen
0,3‑0,5 gramos por 100 ml de medio, lo que
permita ver el desplazamiento de las
bacterias, si existe.
Se pueden utilizar diversos medios de
cultivo con este fin
Si el microorganismo es móvil, se
producirá una zona de difusión del
crecimiento a los lados de la línea de
inoculación. Si la bacteria es inmóvil crecerá
sobre la línea de siembra.
Técnicas para demostrar la movilidad bacteriana
5.2.- Las que se observan por cultivo en medios semisólidos
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