PRODUCCION DE PENICILINA
Alumnas:
De Cunha, Regina
Klekailo, Irina
Velazquez, Veronica
PENICILINA
Alexander Fleming, 1929: observo que Penicillium notatum
inhibía el crecimiento de los estafilococos y esto condujo al
desarrollo del proceso de producción de la penicilina,
iniciándose la era de los antibióticos.
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por
microorganismos que matan o inhiben el crecimiento de otros
microorganismos. Son metabolitos secundarios, producidos
después de la fase de crecimiento exponencial, a medida que el
microorganismo entra en la fase estacionaria.
Las penicilinas son una clase de antibióticos β-lactamicos, que
afectan el proceso de transpeptidacion en la síntesis de la pared
celular de bacterias, provocando su debilitamiento.
La estructura básica de las penicilinas es el ácido 6-
aminopenicilanico (6-APA) formado por la fusión de un anillo de
tiazolidina con otro de beta-lactama. La posición 6-amino puede
tener una gran variedad de sustituyentes acilo.
En ausencia de precursores de
cadenas laterales en el medio de
fermentación, se produce una mezcla
de penicilinas naturales, aunque
solamente la bencilpenicilina (Pen G) y
la fenoximetilpenicilina (pen V) son
importantes terapéuticamente
Cuando se incorporan al medio precursores de los acidos
fenoxiacetico y alilmercapto acético se obtiene fenoximetilpenicilina
(Pen V) y alilmercaptometilpenicilina (Pen O), menos alergénica.
También pueden obtenerse derivados de la penicilina con mayor
actividad antimicrobiana y mayor estabilidad, mediante procesos
semisinteticos a partir de hidrolisis química o enzimática de la Pen G a
6-APA.
Los rendimientos iniciales obtenidos por Fleming con las cepas
de P. notatum fueron de 2 UI/ml, esto es, 1,2 mg/l. El
crecimiento se realizaba sobre la superficie de un medio líquido
(Czapek-Dox-glucosa), en un periodo de 6-12 días y
posteriormente la penicilina se extraía con solventes previa
separación del micelio.
1945: el descubrimiento de P. chrysogenum, permitió
incrementar los rendimientos del producto (120 UI/ml) y
trabajar en cultivo sumergido empleando lactosa como fuente
de carbono y energía, y agua de macerado de maíz (corn-steep
liquor) como fuente de nitrógeno. La incorporacion de
precursores tales como el fenilacetato, en el medio de cultivo,
incrementan los rendimientos del antibiótico(penicilina G)
A través de programas continuados de mejora de cepas,
mediante técnicas de mutación/selección, de reproducción
parasexual y fusión de protoplasmas, combinados con la
optimización de la fermentación, los rendimientos típicos
obtenidos en la actualidad alcanzan los 85.000 UI/ml, o 50g/l.
Ruta biosintética de la penicilina
Producción de penicilina a nivel industrial
La tecnología de producción de
penicilina presenta a nivel
comercial aspectos particulares
que son mantenidos en reserva por
los productores.
Cultivo de P. chrysogenum en reactores de volumen
creciente hasta una escala de 500.000 l
Separación del micelio por filtración
Extracción del antibiótico del caldo
Cristalización o precipitación ácida del mismo.
Producción de penicilina a nivel industrial
Preparación del inoculo
Una cepa de alta producción es un prerrequisito esencial.
La cepa seleccionada debe ser preservada, de manera que
conserve todas las propiedades y características
deseadas.
Esporas desecadas en tierra
Esporas liofilizadas
Esporas congeladas
Se toma una alícuota lo mas pequeña posible de la cepa
conservada y se amplifica por crecimiento en medio
solido o en cultivo liquido.
Medio de crecimiento y esporulación:
FCE: glucosa,glicerol, lactosa, sacarosa o melaza.
FN: licor de maceracion de maiz, peptona,sulfato de
amonio.
Carbonato calcico, cloruro sodico, fosfato, varias sales.
Soporte solido, por ej granos de maiz, arroz, perlita, agar.
Cultivos: se incuban bajo condiciones experimentales
cuidadosamente controladas para estimular el
crecimiento y la esporulación.
*Las esporas de los cultivos líquidos pueden recogerse por
filtración a través de lana de vidrio para eliminar el material
vegetativo.
*Para recoger las esporas de las superficies solidas pueden
utilizarse soluciones salinas (deben inhibir el crecimiento)
Controles previos al proceso de
Preparación de suspensión de producción: si esta contaminada o no,
levaduras viabilidad, prueba de productividad en
frascos agitados.
Trasferencia a un contenedor
apropiado para unirlo al
fermentador de inoculación.
Fermentación
1)Fermentador de inoculación
El medio de la etapa del inoculo se desarrolla para estimular el
crecimiento rápido, pero de forma que impida la producción de penicilina
y la esporulación.
Componentes del medio: Glucosa, sacarosa o lactosa como FCE; agua de
macerado de maíz como FN, fosfato, sulfato amónico, aceites de
consumo como aceite de tocino. (T° optima de crecim: 30°C)
El crecimiento de la etapa de inoculo será cuidadosamente controlado
para asegurar que se transfiera en el estado metabólico correcto para un
comportamiento optimo en la fermentación. Controles: viscosidad,
cambios de pH, sedimentación, utilización de oxigeno, desprendimiento
de CO2, Demanda máxima de O2, potencial redox, niveles de ATP.
-Examen microscópico.
Controles de contaminación!! -Cultivos en medio solido y liquido
a diferentes temperaturas.
Fermentación
2)Fermentador de la etapa final
«Sistema Batch (discontinuo) Alimentado»
Ventajas - duración y la productividad de la fermentación.
-Mantiene el cultivo dentro de los limites de
capacidad de aireación del fermentador.
-Elimina el efecto de inhibición de la glucosa.
La penicila G se produce en fermentadores de acero inoxidable con
capacidad para 40.000 a 200.000 litros.
Proceso altamente aeróbico: precisa de una aireación y agitación eficaz.
Fase de producción de penicilina (Metabolito secundario): comienza
cuando la fuente de carbono se ha consumido casi totalmente. Si se
suministran carbono adicional y nitrógeno en los momentos adecuados, la
fase de producción puede prolongarse durante varios días (aprox 14 dias).
Fermentación
2)Fermentador de la etapa final
Medio de cultivo:
El licor de maceración de maíz aporta
nitrógeno y factores de crecimiento.
Los altos niveles de glucosa inhiben la
producción de penicilina, pero no así los
altos niveles de lactosa, por lo que se
agrega al principio lactosa procedente
de suero de leche en grandes
cantidades como fuente de carbono. A
medida que la lactosa se vuelve
limitante y aumenta la densidad celular
dentro del fermentador, los aportes
continuos de glucosa maximizan el
rendimiento de penicilina.
Fermentación
2)Fermentador de la etapa final
*Los precursores de la cadena lateral de las penicilinas G y V, ácidos
fenilacetico y fenoxiacetico, deben ser suministrados continuamente durante
toda la fase de producción, al igual que las fuentes de nitrógeno y azufre.
*El calor generado por el sistema de agitación y por el organismo a medida
que metaboliza los nutrientes, debe ser rápidamente eliminado para
mantener la temperatura optima, mediante agua de refrigeración que
recircula a través de un sistema de torres de enfriamiento.
*La temperatura optima de producción se encuentra entre 24 y 28 °C. Una vez
ha cesado la producción del antibiótico, la estabilidad del producto
acumulado mejora si la temperatura del caldo se reduce, y es una practica
común hacer ésto en el fermentador o transferir el caldo a un recipiente
separado que ha sido preenfriado. La segunda alternativa presenta la ventaja
de que el fermentador queda libre para ser preparado para la siguiente
fermentación, mientras que el caldo esta siendo trasvasado al equipo de
extracción.
Fermentación
2)Fermentador de la etapa final
Controles durante la fermentación (a intervalos regulares)
-Suministro de O2 apropiado.
-Presencia de organismos contaminantes.
-Cantidad de producto formado.
-Niveles apropiados de: la FCE, la FN, azufre, ácidos fenilacetico y
fenoxiacetico (niveles altos de estos precursores son tóxicos).
-Temperatura, pH.
-Velocidad de crecimiento.
La duración de la etapa de producción en el caso
de operarse un sistema "batch" alimentado es del
orden de las 200 h.
Aislamiento y purificación de penicilina
-Filtración
-Extracción
-Cristalización
-Desecación
Filtración
Separación de los microorganismos de la fase liquida
El primer paso consiste en separar el micelio del medio
de cultivo empleando un filtro rotatorio a vacío tipo
cilíndrico. El filtrado rico en penicilina es luego enfriado
en un intercambiador de calor entre 0 - 4 °C con el objeto
de disminuir la degradación enzimática y química
durante las etapas de extracción posteriores.
Otra alternativa seria la centrifugación y posterior
separación del sobrenadante.
Extracción
Las penicilinas G y V son ácidos fuertes (pKa entre 2.5 - 3.1). Las
formas ácidas son solubles en muchos solventes orgánicos y se
pueden extraer con un alto rendimiento en acetato de amilo o de
butilo a pH 2.5 - 3.0. La extracción se puede realizar en operaciones
continuas, a contracorriente en extractores centrífugos en etapas
múltiples, a temperaturas de 0 - 3 °C. Otra posibilidad es el empleo
de mezcladores estáticos o decantadores, los cuales tienen en menor
costo de inversión.
La extracción de penicilina se puede realizar también en una o más
etapas sucesivas, con una acidificación del caldo filtrado con H2SO4
o H3PO4 al 10% P/V y con el agregado de un agente surfactante
(0,003 - 0,1% P/P, en el solvente), realizándose la extracción y
concentración en extractores centrífugos.
Cristalización
La cristalización se puede realizar desde la fase acuosa si
se desea, siendo los valores críticos las concentraciones
de sodio o potasio, la temperatura, la concentración de
penicilina y el pH. En caso de hacerse la cristalización a
partir de un solvente se requiere también un exceso de
Na + o K+ , siendo los cristales recuperados en un filtro
rotatorio a vacío.
Desecación
Estos cristales son lavados y presecados con un solvente
volátil que también separa impurezas coloreadas. El
secado definitivo se puede realizar con aire caliente,
vacío o calor radiante.
La penicilina cristalina G o V así obtenida puede ser
empleada como tal o como intermediario que es
convertido a 6-APA.
El ácido 6-APA puede ser obtenido a partir de Pen G o Pen
V por vía enzimática (penicilin acilasa) o química.
El 6-APA PUEDE SER MODIFICADO QUIMICAMENTE,
añadiendole distintas cadenas laterales para obtener
penicilinas semisinteticas como ampicilina, amoxicilina,
meticilina. Las penicilinas semisinteticas representan la
mayor parte de las penicilinas comercializadas hoy en
día, debido a que presentan numerosas ventajas desde el
punto de vista clínico, ya que poseen un amplio esprecto
de acción y muchas de ellas se pueden administrar por vía
oral.
FIN
