Técnicas parasitológicas de análisis y
técnicas parasitológicas de tinción .
DOCENTE : Mg. ENRIQUE LEON MEJIA
TÉCNICA PARÁSITO OBSERVACIONES
Test de Graham Enterobius o Taenia
Tinción de Ziehl-Neelsen Cryptosporidium, Cyclospora e Isospora
modificada
Trofozoítos de Debe ser inmediata una vez
Examen en fresco Entamoeba histolytica obtenida la muestra.
Quistes, huevos y Es necesario utilizar
Concentración de heces larvas de parásitos centrífuga.
intestinales
Ha de realizarse cuando se
Tinta china (o a simple Especies de Taenia observan anillos de la Taenia
en las heces.
vista)
CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA
La muestra para el estudio de las diferentes parasitosis intestinales
son las heces. En las heces de los pacientes parasitados podemos
encontrar tanto “elementos” parasitarios microscópicos (huevos,
quistes, larvas) como estructuras visibles sin necesidad de
microscopio como pueden ser proglótides (anillos) de Taenia o
incluso gusanos adultos. Por ello, antes de procesar la muestra
para examen microscópico se debe hacer una inspección visual
para descartar la presencia de estas estructuras visibles, así como
para detectar la presencia de sangre y/o moco en las mismas.
CUÁNDO DEBE TOMARSE LA MUESTRA
Como norma general, cuando se sospecha que un paciente
padece una parasitosis intestinal deben examinarse 3 muestras
de heces recogidas en días diferentes, ya que la eliminación de
quistes y huevos no se produce de forma constante a lo largo del
día ni a lo largo de los días.
CÓMO DEBE RECOGERSE LA MUESTRA
Las heces deben recogerse en un recipiente de plástico de boca ancha y tapa
de rosca,limpio y con las siguientes características:
Boca ancha (no menos de 5 cm de diámetro) para una adecuada
recolección y posterior procesamiento de la muestra.
Capacidad entre 30-50 ml.
Cierre hermético, con tapa de rosca (evitará el derramamiento y la
producción de aerosoles).
Material plástico, desechable, resistente a roturas y transparente o
semitransparente, para poder observar las características y calidad de la
muestra sin necesidad de abrir el bote.
El envase debe etiquetarse o rotularse con los datos del paciente. El
etiquetado o rotulado debe hacerse siempre en la pared del bote, nunca en
la tapa del mismo.
REGISTRO DE LA MUESTRA
A su llegada al laboratorio, los datos de cada muestra (tipo de
muestra, nº de identificación de la muestra, nombre del
paciente…) deben anotarse en el libro de registro, así como los
resultados obtenidos tras su observación macro y microscópica.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
[Link] DE GRAHAM
El test de Graham es una prueba muy sencilla que permite diagnosticar la
parasitación por nematodos del género Enterobius vermicularis (Oxiuros) y, en
ocasiones, por cestodos del género Taenia.
Las hembras de Enterobius realizan la puesta de sus huevos alrededor del
esfínter anal, normalmente por las noches, lo que suele acompañarse de un
intenso picor en la zona. Esta prueba consiste en tomar una muestra de la región
perianal con ayuda de cinta adhesiva transparente para poder observar los
huevos de este parásito y, de esta manera, hacer el diagnóstico.
En cuanto a la parasitación por Taenia, en ocasiones, la salida a través del
esfínter de anillos llenos de huevos de este gusano (proglótides) puede favorecer
el depósito de huevos en la región perianal, por lo que el test de Graham puede
resultar de ayuda en el diagnóstico.
Procedimiento:
Para un adecuado diagnóstico microscópico, la
muestra debe tomarse a primera hora de la
mañana, nada más levantarse el paciente y antes
de que éste se lave, limpie o defeque (en el caso de
la parasitación por Taenia no es necesario que sea
a primera hora de la mañana).
Pegar un fragmento de cinta adhesiva
transparente en el extremo de un portaobjetos
limpio y doblarla sobre el mismo, de tal forma
que la parte adhesiva quede orientada hacia el
exterior, tal y como se muestra en la imagen.
Para tomar la muestra, separar los glúteos para
poder visualizar bien la región perianal y pegar o
apretar la cinta adhesiva sobre los márgenes del
ano.
[Link]ÓN DE ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA
Esta tinción es útil para visualizar quistes de protozoos intestinales
que tienen la propiedad de ser ácido-alcohol resistentes (AAR).
Cryptosporidium es un protozoo (parásito unicelular) intestinal de
elevada prevalencia a nivel mundial. Produce predominantemente
diarrea acuosa con tendencia a la recurrencia en niños y personas
inmunodeprimidas.
Cyclospora e Isospora suelen producir diarrea persistente, sobre todo
en pacientes inmunocomprometidos o con infección por el VIH
(principalmente Isospora).
Procesamiento para la Tinción:
[Link] o identificar el portaobjetos.
[Link] una porción pequeña de las heces (principalmente
aquellas que contengan moco) con ayuda de un aplicador o
una varilla.
[Link] una extensión fina sobre el portaobjetos.
[Link] secar a temperatura ambiente.
[Link] vez seca, fijar la extensión con METANOL o bien
aplicando calor con ayuda de un mechero (pasar el
portaobjetos 2-3 veces sobre la llama de forma rápida para
evitar que la muestra se queme) y dejar enfriar.
[Link] la preparación con el reactivo FUCSINA FENICADA
durante 5 minutos (toda la muestra quedará teñida de color
rojo intenso).
[Link] con AGUA.
[Link] con ALCOHOL-ÁCIDO durante 20-30
segundos (los quistes AAR de estos parásitos
intestinales no se decoloran, permaneciendo de
color rojo-fucsia).
[Link] con AGUA.
[Link] la preparación con el reactivo AZUL
DE METILENO durante 30 segundos.
[Link] con AGUA.
[Link] la preparación y visualizar en el
microscopio con el objetivo 100x (aceite de
inmersión).
C) Observación en el microscopio
Los quistes de estos parásitos se observarán de color de
rojo/fucsia sobre fondo azul.
Quistes de Cryptosporidium
(AAR) tras tinción de
Kinyoun
[Link] EN FRESCO
Se realiza para la observación de las formas móviles de los protozoos
intestinales (trofozoítos). La movilidad puede alterarse si la muestra se
seca por lo que su realización debe ser lo más rápida posible una vez
obtenida la muestra (antes de los 20-30 minutos tras su emisión).
Esta técnica también puede emplearse en los casos en los que no se
disponga de centrífuga o de los reactivos necesarios para realizar la
técnica de concentración de las heces, aunque la sensibilidad es
mucho menor.
4.TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN DE HECES
Estas técnicas tienen como objetivo aumentar la sensibilidad del
estudio parasitológico dado que, con frecuencia, las muestras fecales
contienen escaso número de quistes o huevos de parásitos.
Existen diferentes métodos para concentrar las heces. Uno de los
más utilizados es el de formalina – éter o formalina - acetato de etilo.
Éste es un método que permite separar las heces en dos partes que
no se mezclan, en una se localizarán restos fecales y en otra
(sedimento) los elementos parasitarios.
Método de formol-éter o Ritchie
Método de Charles-
Concentración por sedimentación Batherlemy
Método de Acetato de Etilo
(macro y micro técnicas )
Método de Faust.
Método de Willis Molloy o de
Concentración por flotación solución saturada de cloruro de
sodio.
Método de Sucrosa de
Sheather.
4.1-Técnicas de Sedimentación
Se basa en la concentración de elementos parasitarios por la acción de la gravedad, y se lleva a
cabo suspendiendo las heces en agua corriente, agua destilada o solución salina y dejando que
se verifique un asentamiento natural, o bien se puede acelerar el proceso mecánicamente por
medio de la centrifugación.
Estos métodos son principalmente útiles para la concentración de quistes, ooquistes y huevos,
es decir que son aplicables para casi todos los parásitos fecales y son recomendados de uso
general cuando el diagnóstico no esta orientado a ningún parásito en particular. La desventaja
que tienen con respecto a los de flotación es que a veces la observación microscópica puede
dificultarse por la presencia de la concentración de restos no parasitarios.
De seleccionarse una técnica de rutina se sugiere un método de sedimentación por las
siguientes ventajas: es más fácil de realizar, está sujeto a menos errores técnicos, no requiere
observación microscópica inmediata y es aplicable a la concentración de la mayoría de los
parásitos intestinales.
4.2-Técnicas de Flotación
Al contrario que en la sedimentación, en la cual los parásitos microscópicos, que son más pesados
que las bacterias, y las partículas de alimentos no digeridas van al fondo del recipiente, la flotación
utiliza un medio líquido de suspensión más pesado que los parásitos y éstos suben a la superficie y
pueden ser recogidos de la película superficial.
El primer método de concentración por flotación fue introducido por Bass (1906) para concentrar
huevos de uncinarias en escaso número en las heces.
Para que el método sea útil, no basta con que el medio de suspensión sea más pesado que los
objetos que han de flotar, sino que además no ha de producir retracciones en el parásito que impidan
el reconocimiento.
La ventaja de estos métodos es que producen una preparación más limpia de deyección que el
procedimiento de sedimentación, facilitando mucho su observación microscópica. Las desventajas es
que aquellos parásitos con mayor peso específico que la solución empleada no flotarán (que es lo
que a veces sucede con huevos infértiles de Ascaris lumbricoides o huevos operculados) y que el
tiempo en que debe hacerse la observación microscópica es menor debido a que la película
superficial puede destruirse y los parásitos caer al fondo del tubo.
4.2.1-Método de Faust o de sulfato de Zinc 33%
Esta técnica es especialmente útil para quistes, huevos de Enterobius
vermicularis y huevos de Hymenolepis nana. Todos los elementos parasitarios,
con excepción de los huevos más pesados que el medio
de flotación, se recuperan en altas concentraciones y en condición viable. La
concentración de sulfato de zinc más útil para hacer flotar los elementos
parasitarios más comunes tiene un peso específico de 1.180.
1. Mezclar 10 gramos de heces con 50 ml de solución fisiológica, o agua
destilada.
2. Tamizar a través de un colador metálico.
3. Filtrar sobre gasa en un embudo.
4. Recoger 10 ml del filtrado sobre un tubo de centrífuga.
5. Centrifugar 5 minutos a 1500 r.p.m. Descartar el sobrenadante.
6. Repetir esta operación 3 veces o hasta que el sobrenadante quede
límpido.
7. Agregar al sedimento final 2 o 3 ml de solución de sulfato de zinc 33% y
homogeneizar con varilla.
8. Completar con sulfato de zinc el tubo de centrífuga sin volver a
homogeneizar.
9. Centrifugar 1 o 2 minutos a 1500 r.p.m.
10. Extraer con aro de alambre unas gotas de la película superficial sin
retirar el tubo de la centrífuga o haciéndolo con sumo cuidado para evitar
que por agitación se destruya la película.
[Link]ÓN DE ESPECIES DE TAENIA
Las dos especies de Taenia que infectan al ser humano son Taenia saginata o tenia
de la vaca y Taenia solium o tenia del cerdo. La diferenciación entre ambas resulta
de vital importancia ya que la tenia del cerdo implica riesgo de cisticercosis y tiene
un alto grado de contagio.
Los anillos de la Taenia (proglótides) pueden eliminarse junto con las heces del
paciente o bien de manera espontánea a través del esfínter anal y pueden contener
desde 30.000 hasta 100.000 huevos cada uno, dependiendo de la especie.
Los huevos de ambas especies son indistinguibles microscópicamente, pero los
anillos sí son diferentes en cada una de ellas. Existen dos tipos de técnicas que
permiten diferenciar ambas especies mediante la visualización del número de
ramas uterinas que contienen el/los anillos desprendidos.
Los anillos deben manejarse con extremo cuidado y SIEMPRE CON GUANTES, para
evitar infectarse.
A)Visualización “al trasluz” de anillos de Taenia
•Con ayuda de unas pinzas colocar el anillo o
proglótide de la tenia sobre un portaobjetos. A
continuación, aplastarlo entre dos
portaobjetos, manteniendo éstos fuertemente
unidos mediante gomas o cinta adhesiva
colocada en los extremos y visualizarlo al
trasluz.
•La tenia de la vaca posee un largo canal
central con 15 a 30 ramificaciones uterinas
laterales (imagen lateral), mientras que la tenia
del cerdo posee únicamente de 5 a 10
ramificaciones uterinas laterales que se
subdividen en gruesas digitaciones dendríticas.
B)Método de Tinta China
1. Con ayuda de unas pinzas colocar la muestra de anillo de Taenia en un
recipiente limpio con agua destilada para su relajación y limpieza durante
unas horas. Alternativamente pueden emplearse anillos fijados en
formalina caliente al 10% en solución salina.
2. Colocar el anillo sobre papel secante o absorbente y secarla
cuidadosamente por ambos lados.
3. Localizar el poro genital del anillo (hueco por el que la Taenia expulsa los
huevos) e inyectar la tinta china con una jeringa de insulina o de
tuberculina.
4. Secar con un nuevo papel absorbente el exceso de tinta y colocar la
muestra entre dos portaobjetos limpios ejerciendo presión para que ésta
quede apretada. Mantener los dos portaobjetos fuertemente unidos
mediante gomas o cinta adhesiva colocada en los extremos de los
mismos.
5. Examinar al microscopio con objetivo 4x ó 10x.
6. La tenia de la vaca posee un largo canal central con 15 a 30
ramificaciones laterales mientras que la del cerdo posee únicamente de 5
a 10 ramificaciones laterales que se subdividen en gruesas digitaciones
dendríticas.
7. Una vez terminado el proceso se debe descartar todo material utilizado
en un recipiente que contenga desinfectante, desinfectar la superficie de
trabajo y, por último, lavarse bien las manos.
Figura 1: Proglótide de T. saginata Figura 2: Proglótide de T. solium
tras tinción con tinta china tras tinción con tinta china
Figura 3: Proglótide de T. saginata
sin tinción
LICENCIADA POR
