INTRODUCCIÓN A LA HPLC
FUNDAMENTOS DEL ANALISIS
CROMATOGRAFICO.
Cromatografía Líquida de
Alta Resolución
Dr. JOSÉ ANTONIO FERNÁNDEZ LÓPEZ
Depto. Ingeniería Química
Grupo de Investigación QUIMYTEC
UPCT
INTRODUCCIÓN A LA HPLC
Cromatografía = escribir en colores
Elementos que participan en una
cromatografía
1. Fase estacionaria
2. Fase móvil
3. Muestra
¿Cómo interaccionan?
En general, una cromatografía se realiza
permitiendo que la mezcla de moléculas que se
desea separar (muestra) interaccione con un
medio o matriz de soporte que se denomina fase
estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil)
que es inmiscible con la fase estacionaria se hace
fluir a través de ésta para "lavar" (eluir) a las
moléculas en la muestra.
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Inicialmente se refería a:
High Pressure Liquid Chromatography
En la actualidad hace referencia a:
High Performance Liquid Chromatography
La alta presión permite usar relleno de tamaño de partícula reducido
para lograr la separación de componentes a flujos razonables.
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Características: Parámetros:
Selectividad Naturaleza de la fase estacionaria
Reproducibilidad Tamaño de partícula
Sensibilidad Eluyente (composición y flujo)
Rapidez Detector
Fase Directa:
fase estacionaria polar
fase móvil de baja polaridad
Fase Reversa:
fase estacionaria de polaridad baja
fase móvil de polaridad alta
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Principales mecanismos de interacción
en cromatografía líquida:
– Adsorción superficial
– Partición
– Intercambio iónico
– Exclusión molecular
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CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La fase estacionaria es sólida. La separación se logra
por las diferencias en solubilidad (en fase móvil) y de
retención por adsorción (en fase estacionaria) de la
mezcla de solutos.
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CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
Existen dos modos básicos de operación:
Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar
y fase móvil no polar.
Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no
polar y fase móvil polar.
Inicialmente tuvo más auge la fase normal pero en la
actualidad son más comunes los métodos cromato-
gráficos en fase reversa dada la naturaleza hidrofílica de
las muestras de mayor interés (clínico, contaminación,
alimentos). 13
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CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
Según empleemos fase directa o fase reversa se nos
va a alterar el orden de elución de bandas y el
tiempo de análisis.
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CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
Materiales comerciales empleados como soportes
en cromatografía de adsorción y partición.
Tipo Nombre Tamaño Area específica
comercial partícula (m) (m 2 /g)
Sílice Hypersil 5-7 200
Sílice Lichrospher 10 25
100
Sílice Partisil 5, 10, 20 400
Sílice Spherosil 5, 10, 20 600
Alúmina Spherisorb 5 90
A5W
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Se emplea para el análisis de todo tipo de iones
(inorgánicos y orgánicos).
Las moléculas intercambiadoras se ligan a soportes
específicos.
El material intercambiador de la fase estacionaria es de
diámetro de partícula pequeño (1-10 m) y estructura
microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy
baja respecto al material intercambiador convencional
(10-2 – 10-3 meq/g).
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CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Separación de aniones inorgánicos por
cromatografía de intercambio iónico.
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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
La separación se basa en el tamaño molecular.
Como fase estacionaria se emplean sustancias de
tamaño de poro determinado. También se denomina
cromatografía de permeabilidad por gel (GPC).
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EL EXPERIMENTO CROMATOGRÁFICO
Parámetros de un cromatograma.
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MAGNITUDES CROMATOGRÁFICAS
MAGNITUD SÍMBOLO
Tiempo de retención de una seg. tM
sustancia no retenida
Tiempo de retención seg. tR
Tiempo de retención seg. tR´= tR – tM
reducido
Retención relativa -- = tR2´/ tR1´
Amplitud de bandas a seg. W
media altura
Relación de capacidad -- k´= tR´/tM
Resolución -- RS = 2 [(t R2´- t R1´) / (w2 + w1)]
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EQUIPO
Equipo básico para HPLC.
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SISTEMAS DE INYECCIÓN
Se emplean válvulas inyectoras de volumen (loop) constante
Pueden ser manuales o automáticas
Para variar el volumen de inyección se debe cambiar el
“loop” correspondiente
Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de
inyección
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PRECOLUMNAS
Se trata de una pequeña columna (0,5 – 3 cm) colocada
entre el inyector y la columna
Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la
muestra o del eluyente, en la columna analítica
Va a permitir alargar la duración de las columnas
Debe ser del mismo relleno que el de la columna analítica
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COLUMNAS
Gran avance en la última
década por el progreso en
la tecnología de rellenos y
columnas
Rellenos más uniformes y
de menor tamaño
Fases químicamente liga-
das a los soportes
aumentando su eficacia y
resolución
Mejora en los métodos de
empaquetado
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COLUMNAS
Influencia de la longitud de la columna y del tamaño de
partícula en la duración del cromatograma
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COLUMNAS
Ventajas de la “High Speed HPLC” con columnas cortas
Tiempo de análisis reducido
Menor consumo de disolventes
Menor dispersión de los solutos a analizar
Ahorro de costes
Mayor sensibilidad
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DETECTORES
Cualquier propiedad física o química
que se pueda medir en la disolución
podría usarse como método de
detección Rapidez
Los detectores en HPLC no son Reproducibilidad
destructivos Sensibilidad
Se pueden clasificar en: Linealidad
Detectores que Estabilidad
miden una propiedad de
la fase móvil
Detectores que
miden una propiedad de
los solutos
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DETECTOR UV/VIS
Longitudes de onda de corte en el UV de disolventes
usados en HPLC
Disolvente Longitud de onda
Acetona 330 nm
Acetonitrilo 190 nm
Agua 190 nm
Cloroformo 245 nm
Éter Dietílico 215 nm
n-Hexano 195 nm
Metanol 205 nm
Tetrahidrofurano 212 nm
Tolueno 284 nm 43
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DETECTOR FOTODIODOS
Permite registrar la absorbancia simultánea en todo el
rango UV/VIS.
La muestra es atravesada por luz blanca (todas las λ) y el
policromador dispersa la luz en las diversas λ que la
componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada
diodo incide una λ diferente, que manda la información al
sistema de análisis de datos.
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DETECTOR FOTODIODOS
0 , 60
0 , 55
0 , 50
0 , 45
Posibilidades de un
0 , 43 05
0,30
AU
0,25
detector de fotodiodos. 0,20
0,15
0,10
0,05
2 5 0 ,0 0 0 , 0 0
3 0 0 ,0 0 -0 , 05
3 5 0 ,0 0
0,5 0 1, 0 0 1, 5 0 2, 0 0 2,5 0 3, 0 0 3, 5 0 4, 00 4, 50 5, 0 0 5,
50 6, 0 0 6, 5 0 7,0 0
M i nut e s
0,60 300,00
280,00
0,40
260,00
nm
AU
Cafeína - 5 ,35 7
0,20
240,00
220,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 Minutes
Minutes
45
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DETECTOR DE DISPERSIÓN DE LUZ
Válido para aquellos solutos que
sean claramente menos volátiles
que la fase móvil.
El eluyente es evaporado con una
corriente de N2 dejando una nube
de finas partículas sólidas que
entran en la zona de detección.
Las partículas se detectan por la
luz que procede de un diodo láser
y llega al fotodetector por
dispersión.
Sólo tampones volátiles en la fase 49
móvil.
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APLICACIONES
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