Histología teóricos
2022
Técnicas histológicas
Profesor: Marco Agustín Pawluk Ochoa
FHAB
La técnica histológica incluye una serie de pasos
que son: fijación, inclusión, corte, coloración y
montaje.
Obtención del tejido o muestra
El tejido se puede obtener de una biopsia de un órgano de un paciente o de un
animal vivo. En todos los casos se debe tomar una muestra representativa y
pequeña del órgano objeto de estudio. Otra posibilidad es obtener una muestra
de un órgano o tejido de una persona o de un animal post mortem; en dicho
caso, se dice que el material proviene de una necropsia. Los materiales
provenientes de necropsias humanas han sufrido en muchos casos procesos de
autólisis post mortem. El empleo de material post mortem procedente de
animales de experimentación permite acortar los tiempos entre la eutanasia y la
toma de la muestra para disminuir la ocurrencia de los fenómenos de autólisis
(autodigestión lisosomal) y proceder con la fijación en forma inmediata. Las
muestras para microscopia óptica deben tener dos características: por un lado,
deben carecer de cápsulas que impidan o dificulten la entrada del fijador y de los
solventes empleados, y por otro deben ser de pequeño tamaño (cubos de
aproximadamente 5 mm de lado), para permitir la entrada del fijador hasta el
centro de la muestra
Fijación
Rutinariamente, las muestras se sumergen en fijadores líquidos. El volumen del
fijador debe ser importante, recomendándose que la relación sea de al menos 10:1
respecto del volumen de la muestra. Este procedimiento se denomina fijación por
inmersión. Durante la inmersión, el fijador difunde desde la periferia de la muestra
hasta el centro de ésta evitando los fenómenos de autólisis, deteniendo el
metabolismo celular y preservando la estructura de las células que componen los
tejidos y los órganos. Sin embargo, el proceso de fijación no es inmediato y algunos
órganos (como los que pertenecen al sistema nervioso, el páncreas y las glándulas
suprarrenales) suelen experimentar alteraciones tempranas de su estructura. En
estos casos y en numerosos estudios experimentales, es conveniente fijar los
óganos por perfusión. Este procedimiento consiste en introducir el fijador o la
mezcla fijadora por medio de una aguja inserta en el ventrículo izquierdo o en la
arteria aorta abdominal del animal de experimentación anestesiado. En este caso,
la fijación se alcanza antes de la muerte del animal y la eutanasia ocurre durante el
procedimiento de fijación. Luego se extirpan los órganos objeto de estudio y se
disecan las áreas de interés, las cuales se pueden posfijar mediante inmersión para
asegurar una mejor preservación.
Fundamentos de la fijación
La fijación tiene por objetivo preservar la estructura, la ultraestructura y la composición
química de las células y de los tejidos de manera tal que su observación por medio del
microscopio revele fielmente la morfología y la localización de sus distintos
componentes. Además, la fijación impide los procesos de autólisis que ocurren durante
la muerte celular, detiene el metabolismo celular y evita la acción de gérmenes
(putrefacción) que destruyen las muestras. Un buen fijador no debe extraer
componentes químicos de las células, no debe agregar elementos (precipitados,
cristales), debe tener un pH que se aproxime al pH neutro (generalmente, pH 7,2-7,4),
debe tener una osmolaridad similar a la del tejido que evite el colapso de estructuras
como pueden ser cavidades con soluciones coloidales (p. ej., folículos tiroideos o
blástulas embrionarias), y además, un buen fijador debe penetrar al interior del bloque
o muestra logrando la fijación de la periferia y del centro de ésta. Los fijadores
endurecen las piezas durante el proceso de fijación, lo cual no es bueno si la dureza del
tejido obtenida es superior a la del medio de inclusión. En consecuencia, el
endurecimiento excesivo del tejido debe evitarse porque lo volvería quebradizo y si es
insuficiente lo vuelve friable
Tipos de fijadores
Los fijadores pueden ser:
• Fijadores químicos:
A- Fijadores simples.
B- Fijadores complejos o mezclas fijadoras.
• Fijadores físicos.
a. Frío.
b. b. Desecación-calor.
Fijadores químicos Simples
Simples: El fijador más usado en microscopia óptica es el formaldehído 4% P/V, y el
fijador más empleado en microscopia electrónica es el glutaraldehído. El grupo aldehído
tiene la particularidad de formar enlaces covalentes con grupos amino (-NH2) y carboxilo (-
COOH) de las proteínas creando puentes metilénicos entre ellas. De esta forma, se origina
un enrejado molecular que precipita en el interior de la célula y preserva la estructura. La
presencia de dos grupos aldehído en la molécula de glutaraldehído hace que éste sea un
fijador más «enérgico» y de elección para la microscopia electrónica (estudios
ultraestructurales). El formaldehído comercial se obtiene en soluciones al 40% P/V en agua
(formol) y se lo diluye 10 veces para obtener la formalina, cuya concentración final de
formaldehído es del 4% P/V. Como ya se ha mencionado anteriormente, los tejidos se
sumergen en esta solución o se perfunden con la misma. Con la finalidad de mantener el
pH y la osmolaridad, las diluciones se realizan con una solución buffer o amortiguadora de
fosfato 0,1 M pH 7,4. En ambos casos, el empleo de mezclas frías (4 °C) retarda los procesos
de autólisis y favorece la acción del fijado
Mezclas fijadoras: La más empleada en la microscopia óptica es la mezcla de Bouin, que
contiene ácido pícrico, formol y ácido acético. La presencia de ácido acético en esta mezcla
favorece la penetración del fijador en la muestra. Otras mezclas son el líquido de Zenker
(bicromato, acético) y el líquido de Helly (bicromato, formol).
Fijadores físicos
El frío permite conservar las muestras biológicas. En
histología se emplea la congelación, la cual se puede
realizar en nitrógeno líquido o por medio de mezclas
refrigerantes con hielo seco y acetona. Los bloques de
tejido se mantienen en congeladores (freezers) y se cortan
en secciones utilizando un equipo denominado crióstato.
La congelación no desnaturaliza las proteínas, y muchas de
sus propiedades reaparecen al hidratarse el tejido; a
consecuencia de ello se reproducen procesos de autólisis,
razón por la cual se dice que el frío no es un fijador
estrictamente hablando.
Deshidratación
La inclusión tiene por objetivo endurecer homogéneamente el tejido
para lograr obtener secciones delgadas que puedan observarse al
microscopio óptico. Con esta finalidad, el tejido es embebido en
parafina o en un medio sintético similar (Paraplast®). Estos medios son
hidrofóbicos; por tanto, antes de la inclusión en parafina, la muestra
debe ser deshidratada. La deshidratación se logra mediante pasajes en
alcoholes de gradación creciente (alcohol 50°, 70°, 96° y 100°). Luego
el tejido se sumerge en un solvente orgánico, generalmente xileno o
tolueno, que desplaza al alcohol y que es solvente de la parafina.
Durante este paso, el tejido se vuelve translúcido, razón por la que
esta fase se conoce como aclaración. Si la muestra se ve de «aspecto
lechoso», la deshidratación ha sido insuficiente y hay que recomenzar
el proceso.
inclusión
Durante este paso, el bloque se embebe en parafina o medios sintéticos
análogos como el paraplast. A temperatura ambiente, la parafina (o el
paraplast) tiene la consistencia de una vela. Es necesario calentarla para
que pase al estado líquido. Para ello, los bloques de parafina se ponen en
un vaso de precipitado en una estufa a 60 °C. Una vez que el tejido ha sido
aclarado, se sumerge la muestra en un recipiente que contiene parafina
líquida/xilol (mezcla 1:1) y se lo deja en el interior de la estufa de inclusión.
A continuación, se hacen otros dos pasajes de 2 h cada uno en parafina
líquida pura durante los cuales la parafina desplaza al xilol. Se construye un
molde en papel, en aluminio o en barras de metal («barras de Leuckart»),
en el que se coloca el bloque de tejido embebido en parafina y se llena con
parafina líquida orientando el bloque de tejido según el sentido en el que
luego se quieran hacer los cortes. Después se enfría el molde, de modo que
la parafina se solidifica y se obtiene el taco
Corte
Los tacos de parafina que contienen la muestra se cortan con un instrumento
denominado micrótomo. El micrótomo se asemeja a una máquina de cortar
fiambre; posee una manivela que se gira manualmente (también los hay
automáticos) y que hace que la pieza, donde se fija el taco, avance
automáticamente apenas unos pocos micrones y descienda sobre el filo de la
cuchilla para realizar la sección. Generalmente, las secciones para microscopio
óptico tienen un espesor de 5 mm. Las secciones se levantan con un pincel y se
sumergen en un baño termostático con agua a 40 °C. Esto hace que las secciones
se estiren. Luego se sumerge un portaobjeto gelatinado o pretratado con albúmina
en el baño y, con ayuda de un pincel, se ubica la sección sobre la superficie del
portaobjeto mientras se eleva éste. Los portaobjetos con las secciones se dejan
secar a temperatura ambiente o sobre una platina a 40 °C para que las secciones se
adhieran a la superficie del vidrio. La finalidad del pretratamiento con gelatina o
albúmina es lograr que las secciones se fijen al portaobjeto y no se despeguen
durante los procedimientos posteriores
Desparafinación e hidratación
Para colorear las secciones, dado que los colorantes
son soluciones acuosas, es necesario quitar la
parafina, es decir, desparafinar las secciones. Esto se
logra sumergiendo los portaobjetos con las secciones
en xilol dentro de un recipiente ad hoc denominado
Coplin. Este solvente orgánico remueve la parafina.
Luego, las secciones se hidratan sumergiéndolas en
soluciones con alcoholes de graduación decreciente
(100°, 96°, 70° y 50°) y, finalmente, se hace un pasaje
en agua destilada
Coloración
Las secciones se tiñen de rutina con hematoxilina y
eosina. La hematoxilina es un colorante natural que se
obtiene de una leguminosa de América Central, el
«palo de Campeche», y la eosina es un colorante
artificial derivado de la fluoresceína. Primero se
sumergen los portaobjetos en una solución con
hematoxilina, luego se realiza el viraje con agua de
canilla o una solución alcalina débil (el color de la
hematoxilina cambia del rojo al azul) y, por último, se
sumergen las secciones en eosina (color rojo)
Los fundamentos de la coloración con
hematoxilina y eosina
Se basan en principios químicos, por lo que es necesario revisar algunos conceptos básicos de la
química. Una sustancia básica es aquella capaz de aceptar o captar protones y que, después de
aceptarlos, queda con una o más cargas positivas; mientras que una sustancia ácida es aquella
capaz de liberar o ceder protones y que, después de liberarlos, queda con una o más cargas
negativas. En los tejidos existen moléculas anfóteras capaces de comportarse como sustancias
ácidas o básicas dependiendo del pH del medio. En general, las sustancias anfóteras se comportan
como ácidos en un medio básico y como bases en un medio ácido. Para ello debemos tener en
cuenta el punto isoeléctrico (pI). El pI es el pH del medio en el cual la sustancia anfótera se
comporta tanto como ácido o como base. Por debajo de ese valor de pH (pI), las sustancias se
comportan como bases aceptando protones y quedando cargadas en forma positiva, mientras
que a un pH superior al pI las sustancias anfóteras se comportan como ácidos liberando protones
y quedando cargadas en forma negativa. Tanto los ácidos nucleicos como las proteínas son
sustancias anfóteras; sin embargo, el pI de los ácidos nucleicos es tan bajo (2 o menos) que al pH
fisiológico y al pH de la mayoría de las técnicas empleadas se comportan como ácidos liberando
protones y quedando con carga neta negativa. De ahí que nos refiramos siempre a ellos como los
«ácidos» nucleicos. Su carga negativa se debe principalmente a la ionización de los fosfatos que
componen sus nucleótidos. Por el contrario, las proteínas tienen un pI próximo o ligeramente
superior al pH neutro y al pH de las preparaciones, por lo que suelen comportarse como bases
aceptando protones y quedando con carga positiva. En las proteínas, los grupos amino (-NH2)
aceptan protones, mientras que los grupos carboxilo (-COOH) o sulfhidrilo (-SH) liberan protones.
Por otro lado, los colorantes se pueden clasificar en dos grupos: a) básicos,
como la hematoxilina, el azul de metileno, los azures, el azul de toluidina y
el verde de metilo, y b) ácidos, como la eosina, el naranja G y la fucsina
ácida. Los colorantes básicos, de los cuales la hematoxilina es el mejor
representante, son colorantes que aceptan protones, por lo que quedan
cargados en forma positiva: son colorantes catiónicos. En los tejidos, los
colorantes catiónicos se unen a las sustancias ácidas que tienen cargas
negativas, es decir, a los ácidos nucleicos (ADN y ARN). En consecuencia,
todos los núcleos de las células tienen afinidad por los colorantes básicos y
decimos que son basófilos (se tiñen de color azul violáceo). Las zonas de
eucromatina son basófilas leves y las zonas de cromatina condensada y los
nucléolos son intensamente basófilos. En cambio, el citoplasma de una
célula tiene una coloración acorde con su actividad específica; así, el
citoplasma de una célula con una importante actividad de síntesis proteica y
que, por tanto, es rica en retículo endoplásmico rugoso y/o con muchos
polirribosomas, tendrá un citoplasma basófilo. Ejemplos de ello son los
plasmocitos que sintetizan las inmunoglobulinas (los anticuerpos son
proteínas), las células de los ácinos serosos de la parótida y el páncreas que
sintetizan enzimas digestivas.
Los colorantes ácidos como la eosina liberan protones y quedan cargados en forma
negativa. Son colorantes aniónicos. En los tejidos, los colorantes aniónicos se unen a
las sustancias que tienen cargas positivas, generalmente a los grupos amino (-NH2)
de las proteínas. En consecuencia, los citoplasmas de las células, dado que poseen
proteínas, tienen generalmente afinidad por los colorantes ácidos, se tiñen de color
rosado al rojizo, y decimos que son acidófilos. La acidofilia o eosinofilia puede ser
mayor si encontramos en el citoplasma un gran número de mitocondrias, dado que
sus membranas y su matriz son muy ricas en proteínas (poseen las enzimas de la
cadena respiratoria, del ciclo de Krebs y de la fosforilación oxidativa). Las células
con elevados requerimientos energéticos, como las células parietales del estómago,
que poseen una gran cantidad de mitocondrias, son intensamente acidófilas. Una
célula de un ácino pancreático que tiene gran síntesis proteica, con un retículo
endoplásmico rugoso muy desarrollado en su parte basal y que posee vesículas
secretoras con enzimas digestivas (proteínas) en su citoplasma apical, puede
presentar gran basofilia basal y acidofilia apical.
Deshidratación
El siguiente paso es el montaje, para el que
generalmente se emplea una sustancia
hidrofóbica. Dado que las secciones están en un
medio acuoso durante la coloración, es
necesario deshidratarlas mediante pasajes en
alcoholes de graduación creciente (50°, 70°, 96°
y 100°) y luego sumergirlas en xilol, el cual
desplaza al alcohol y permite la penetración del
medio de montaje.
Montaje
Se añade una gota de bálsamo de Canadá o de un medio de
montaje sintético (DPX® o Histomount®) e inmediatamente
se deposita una delgada lámina de vidrio —denominada
cubre-objeto— sobre la sección evitando la formación de
burbujas de aire. Una vez que el medio de montaje se
solidifica, el preparado está listo para su observación al
microscopio sin riesgos de que se mueva el cubreobjeto. Los
preparados así montados duran décadas y pueden volver a
observarse cuantas veces sean necesarias. Los preparados
forman parte de los archivos de preparados histológicos que
permiten hacer estudios retrospectivos.
Muchas gracias por su atención!
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