Técnicas inmunoquímicas e

inmunoanálisis.
Técnicas de Interacción secundaria

PROF: DIAZ GABRIELA

MATERIA: INMUNOLOGÍA
AÑO:2020
Las técnicas inmunoquímicas o inmunoanálisis utilizan las reacciones antígeno-
anticuerpo para medir o detectar la presencia o ausencia de un analito

Van a depender de:

- Tipo de antígeno y anticuerpo
- Afinidad y avidez
- Concentración
- Temperatura
- Ph del medio Condiciones del medio
- Fuerza iónica
 ¿Qué podemos estudiar con las técnicas
inmunoquímicas o inmunoanálisis?

Cuales pueden ser mis analitos?? Anticuerpos:

- Búsqueda de anticuerpos
protectores
- Búsqueda de anticuerpos
causantes de enfermedad
- Otros tipos de anticuerpos
Antígenos:
- Búsqueda de patógenos
- Búsqueda de toxinas
- Determinación de
hormonas o metabolitos
- Identificación de tipos
celulares
- etc
 Interacción antígeno-
anticuerpo
En la interacción in vitro de un antígeno (Ag) con su correspondiente anticuerpo
(Ac) se distinguen dos etapas:
•La interacción primaria no visible y
•La interacción secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la
aparición de un fenómeno visible (como la aglutinación o la precipitación).

No siempre que se produce la interacción primaria Ag-Ac, se produce la

interacción secundaria, ya que, para conseguir fenómenos visibles, son
indispensables determinadas concentraciones y características de los Ags y Acs.
 Sensibilidad de las técnicas
Interacción secundaria Interacción
primaria

Menor Mayor

Precipitación en Precipitación en Técnicas de interacción

Aglutinación
medio gelosado medio liquido primaria

*Las reacciones de interacción secundarias son menos sensibles

miden concentraciones en el orden de los mg/ml a μg/ml (excepto
la nefelometría que posee una sensibilidad semejante a la interacción
primaria)

*Las reacciones de interacción primaria poseen mayor sensibilidad,

en el orden de los ng/ml a pg/ml.
TÉCNICAS DE INTERACCIÓN
SECUNDARIA
 Importancia de la concentración
de antígeno y de anticuerpo
Cc de Ag < Cc de Acs: Cc de Ag > Cc de Acs:
Todos los epitopes Todos los sitios de
están ocupados, no union de los Acs
así con los sitios de estan ocupado, no asi
unión de los Acs. los epitopes de los
Ags.
No se forma una
unión cruzada entre No se forma una
los componentes . Se forman unión cruzada entre
IC grandes los componentes .
e
insolubles

IC: INMUNOCOMPLEJOS
FENOMENO DE ZONA O PROZONA
 Importancia de la valencia en las
técnicas de interacción secundaria
•Valencia del Ac: da idea del número de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta
manera, un Ac bivalente posee dos sitios capaces de reconocer al Ag.

•Valencia del Ag: nos habla del máximo número de epitopes que posee.

Para que se pueda producir la interacción secundaria Ag-Ac con la consecuente

formación del inmunocomplejo, tanto el Ag como el Ac deben ser, al menos, bivalentes.
 Técnicas de interacción
secundaria
Las técnicas inmunológicas que evidencian la interacción Ag-Ac a través
de una reacción secundaria (precipitación o aglutinación) son,
generalmente, más económicas y sencillas que aquellas de interacción
primaria

AGLUTINACION - Antígeno particulado (natural o artificial).

PRECIPITACION - Antígeno soluble

Reacciones de aglutinación
Clasificación de las reacciones de aglutinación:

•Directa: antígenos naturalmente particulados.

•Indirecta: antígenos artificialmente particulados.
•Indirecta Inversa: anticuerpos unidos a partículas.
 Reacciones de Aglutinación
* Aglutinación directa: Antígeno celular es aglutinado directamente por el
anticuerpo
- Grupos sanguíneos: antígenos en la superficie de los GR
- Detección de anticuerpos anti Brucela y Salmonella
Eritrocitos, bacterias, hongos pueden ser aglutinados por anticuerpos.
 AGLUTINACION DIRECTA

Ag particulado
Ej: bacterias, GR, Acs específicos
Parásitos, etc.

Ej APLICACIONES: Tipificación de grupo sanguíneo

Reacciones de Aglutinación
* Aglutinación indirecta: aglutinación de células artificialmente
recubiertas de antígeno soluble o partículas inertes portadoras pasivas
de antígenos solubles.
Partículas de gelatina con Ags de Treponema pallidum
Hemaglutinación indirecta (HAI chagas) para la detección de
anticuerpos anti Tripanosoma cruzi.
 AGLUTINACION INDIRECTA
El antígeno de interés no es particulado. Para hacerlo artificialmente particulado se sensibilizan partículas de
látex/gelatina o GR con el antígeno de interés.

1º Sensibilización de la célula o partícula con el Ag soluble

Ya viene
hecho por el
fabricante del
Partícula inerte Antígeno reactivo
Antígeno
o célula soporte artificialmente
soluble de
particulado
interés

2° Incubación con la muestra del paciente

Antígeno
artificialmente
Muestra del paciente Malla de aglutinación
particulado
Reacciones de aglutinación
Aglutinación indirecta inversa: De manera alterna, el antígeno puede
ser localizado recubriendo partículas de látex o eritrocitos con
anticuerpo purificado y practicando la llamada aglutinación inversa.
Se utiliza para detectar o dosar Ag solubles
 Aglutinación Indirecta reversa

1º Sensibilización del GR o partículas con el Ac

Ya viene
hecho por el
fabricante del
reactivo

2° Reacción de aglutinación

Ag solube
(muestra)
 Reacciones de aglutinación
Las técnicas de aglutinación permiten hacer determinaciones de tipo:
* Cualititativas (positivo/negativo)

* Semicuantitativas (Titulación)

Titulación: dilución seriada de la muestra, se informa la inversa de la ultima dilución positiva.

TECNICAS DE
PRECIPITACIÓN
 REACCCION DE
PRECIPITACION
ANTIGENO PARTICULADO---------AGLUTINACION

ANTIGENO SOLUBLE---------------PRECIPITACION

La reacción de INMUNOPRECIPITACION se produce cuando un antígeno soluble es reconocido por

un anticuerpo especifico, formando un COMPLEJO ANTIGENO-ANTICUERPO dando como
resultado un enrejado insoluble.

*Requisitos del antígeno y del anticuerpo para que su interacción sea determinada por técnicas de
inmunoprecipitación:
- - Antígeno: multivalentes o minimamente bivalente
- - Anticuerpo: mínimamente bivalente.
Técnicas de interacción
secundaria - PRECIPITACION
1) Técnicas de precipitación en gel:
POR DIFUSION SIMPLE: - Inmunodifusion radial (IDR)*
- Doble IDR(outcherlony)

POR DIFUSION FORZADA: - Inmunoelectroforesis (IEF)*

- Contra Inmunoelectroforesis (CIE)
- Rocket (cuantitativo)
- Inmunofijación*
Técnicas de interacción
secundaria - PRECIPITACION
3) Técnicas de precipitación en medio liquido:
- Turbidimetría *
- Nefelometría *
 Reacciones de precipitación
en gel
Los medios en que se realizan estas reacciones son principalmente agarosa y gel de agar (el agar es
obtenido de las algas)
AGAROSA:
La agarosa es una fracción extraída del agar y es la responsable fundamental del poder gelificante de éste.

Presenta una histéresis de gelificación importante (histéresis: diferencia entre la temperatura de

gelificación y la de fusión), dado que gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 - 45°C y funde a
temperaturas entre 80 - 95°C.

La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte de extenso uso en técnicas de separación
tales como Electroforesis, Cromatografía y otras, empleadas en el campo de la Bioquímica y Biología
Molecular. Asimismo, es un producto neutro y fácilmente derivatizable, por lo que es sencillo fijar a su
estructura proteínas tales como enzimas, antígenos o anticuerpos. La ausencia de toxicidad que presenta
la hace muy cómoda para el trabajo.
Al igual que en las técnicas de aglutinación, las de precipitación también están
influenciadas por la concentración de antígeno y anticuerpo
 INMUNODIFUSION
RADIAL (IDR)
La IDR se utiliza para determinar la concentración o cantidad de un
antígeno o Ac especifico en una muestra (la muestra puede ser suero,
plasma o algún fluido biológico como saliva, o solución de proteínas
purificadas para investigación u otras aplicaciones no clínicas)

Algunas aplicaciones clínicas:

- Medición de las proteínas del complemento (C3,C4,C1,C5 etc)
- Medición de proteínas de la coagulación ( fibrinógeno, plaminógeno, etc)
- Medición de inmunoglobulinas y sus subclases (IgG, IgA, IgE, IgM, IgG1,
IgG2…)
- Otras proteínas humanas (albumina, haptoglobina, transferrina, etc)
 INMUNODIFUSION
RADIAL (IDR)
Se incorpora a la agarosa al 3% el reactivo inmune de interés (ejemplo: anticuerpos anti C3 Confecciones
para medición de C3 en suero).
realizadas por
Se distribuye el gel en una placa de forma homogénea y se deja solidificar el fabricante
Se realizan huecos en el gel, sitio en el que luego se colocara el antígeno de interés a medir.
 INMUNODIFUSION
RADIAL (IDR)
La precipitación se produce cerca de la zona de sembrado del pocillo,
pero se re-disuelve y difunde, y vuelve a precipitar hasta alcanzar la zona
de equivalencia (donde las cc de Ag y Ac son iguales).
A mayor concentración de mi analito, más va a difundir.
El área del anillo de precipitación, expresado en diámetro al cuadrado
(d2) es directamente proporcional a la concentración del antígeno en la
muestra.
 IDR
Factores que influyen en el diámetro final del anillo de precipitación:
* Volumen de muestra
* Concentración de anticuerpo o Ag en el medio semisólido
* PH del medio gelosado
* Tiempo de incubación
* Temperatura de incubación: a mayor temperatura, menor tiempo de incubación.
* Superficie donde se incuba (libre de vibraciones y nivelada)
* Humedad del medio (siempre incubar en cámara húmeda para conservar
humedad del gel)
IDR
Gel conteniendo el anticuerpo especifico para
el antígeno a determinar
En cada pocillo se agrega la muestra que
contendría el antígeno de interés y que se
desea cuantificar.

La placa se incuba a temp ambiente o 22 °C

controlado un periodo de tiempo que puede
variar

El antígeno difunde radialmente a través del gel

de agarosa conteniendo un anticuerpo mono
especifico.
 IDR

PROCEDIMIENTO
para método de
IDR cuantitativo:
 DETERMINACION DE ALTA PRECISION

2- DERTERMINACION DE RUTINA
Otra forma de determinar la concentración es medir el anillo en interpolarlo en tablas de valores pre
determinados que vienen en los kits comerciales sin necesidad de trazar la curva de calibración. Solo se debe
largar un control y que este caiga dentro del intervalo pre determinado del kit para ese control. Esta es la forma
mas utilizada en la rutina de un laboratorio de análisis clínico.
 IDR-LECTURA
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MICROMETRO

LECTURA DE PLACAS
MUCHAS
GRACIAS!!!