INTRODUCCION A LA
HISTOLOGIA
TECNICAS HISTOLOGICA
INTRODUCCION
La Histología incluye el estudio de las células, los
tejidos, los componentes extracelulares y los órganos
Previamente debemos conocer las unidades de medida
que se utilizan en Histología
Los componentes de las células y los tejidos se miden
utilizando el sistema métrico. Las unidades que se
utilizar son el milímetro (mm), el micrómetro (un) y el
nanómetro (nm)
Equivalencias:
1mm = 10-3 m
1 un = 10-6m
1 nm = 10-9m
INTRODUCCION
El ojo del ser humano puede ver desde un tamaño
de 0,2 mm equivale al grosor de una hoja de afeitar
La microscopia óptica puede observar figuras desde
un tamaño 0,2 un ( 100 nm) que equivale al tamaño
de un virus
La microscopia electrónica de transmisión puede
observar figuras desde un tamaño de 0,2 nm que
equivale al tamaño de un átomo
La microscopia de efecto túnel puede observar
figuras de tamaño menores de 0,1 nm o sea menor
que el tamaño de un átomo
OBTENCION DE LA MUESTRA
Para su estudio, las muestras se pueden dividir en:
Muestras liquidas y muestras solidas
MUESTRAS LIQUIDAS: Muestras de humores, secreciones
(sangre, saliva, liquido vaginal, orina, leche, etc..)
MUESTRAS SOLIDAS: Muestras de tejidos u órganos
Necropsias : Examen u obtención de tejido de un
organismo muerto
Biopsia: Examen u obtención del tejido de un organismo
vivo
Se utilizan diversas técnicas para la obtención de la
muestra, como ser: Inscinsional, excisional por
sacabocados, por punción, absorción y raspado
PASOS PARA LA PREPARACION DE
UNA MUESTRA DE UN TEJIDO
Obtención de la muestra (Punción, incisión,
raspado, absorción)
Fijación
Deshidratación
Aclaramiento
Impregnación
Corte
Montaje
Tinción
Estudio
FIJACION
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias
químicas que tienen varias finalidades:
Conservar los tejidos
Aumentar la dureza del tejido para facilitar el corte para la preparación
de finas películas
Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos
No cambiar significativamente de forma y/o volumen
Los tejidos fijados permiten una correcta y clara tinción de los mismos
Los tejidos fijados deben en lo posible mantener las mismas
características de los tejidos vivos, por lo tanto, los fijadores
mantienen la estructura celular con la menor variación posible
Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte
de la célula. Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de
otra manera iniciarían la Autolisis y llevarían a la degeneración post
mortem
FIJACION
Los agentes fijadores mas utilizados son:
Formadehido al 5%
Formol al 10% o formalina (el mas utilizado)
Glutaraldehido al 2,5%
FIJACION
Es muy importante este paso porque depende
de el, el estudio de la muestra.
Cuando se hace una mala fijación es
imposible observar en el microscopio las
estructuras de un tejido
El agente fijador mas usado es el formol al
10% o Formalina
AUTOLISIS O AUTODIGESTION
Es el proceso que se desencadena en la célula desde el
momento que deja de recibir un normal aporte de oxigeno o
de nutrientes. La muerte celular produce la autolisis y la total
alteración de las características estructurales de la célula
La autolisis ocurre por que la falta de oxigeno y de nutrientes
interrumpe la producción de ATP (molécula energética). En la
membrana plasmática de la célula existen una serie de
proteínas que activamente (con gasto de ATP) mantienen las
concentraciones iónicas normales dentro de la célula
La falta de ATP detiene el funcionamiento de estas proteínas
lo que produce la entrada anormal de iones principalmente,
sodio, cloro y calcio. El sodio y el cloro atraen el agua que a
su vez produce un edema en la célula
AUTOLISIS O AUTODIGESTION
El calcio activa una serie de enzimas intracelulares (fosfolipasas)
que perforan las membranas de las organelas
Dentro del conjunto de organelas la destrucción de las membranas
de los lisosomas produce la mayor alteración de la célula
Los lisosomas son vesículas delimitadas por membrana plasmática
que contiene una batería de enzimas hidrológicas: fosfatasa acida.
Ribonuclease, proteasa, sulfatasa, lipasa, glucuronidasa
Todas estas enzimas digieren proteínas, lípidos, ácidos nucleídos,
etc.
La liberación anormal de estas enzimas dentro de la propia célula
degrada su citoesqueleto y sus organelas
Por tanto la fijación de los tejidos debe ser sumamente rápida para
evitar el comienzo de estos cambios
DESHIDRATACION
Para comprender los siguientes pasos debemos
saber que nuestro fin es preparar una muy fina
rebanada de tejido para colocar arriba de un
portaobjeto y observarla en un MO
Debe ser una fina capa de tejido para que la
luz del microscopio la atraviese y observemos
bien cada uno de los detalles
Antes de cortar el tejido el mismo debe ser
incluido en un medio rígido que nos permita
hacer cortes muy finos (5 a 15 un)
DESHIDRATACION
El medio de inclusión utilizado en forma
rutinaria es la parafina
Por lo tanto, ahora debemos hacer que la
parafina se introduzca dentro de la muestra
fijada
La muestra hasta ahora se halla en un fijador
acuoso y la parafina no es soluble en agua,
por lo que la muestra debe ser deshidratada
DESHIDRTACION
Se elimina el fijador y se extrae el agua del
tejido
Para evitar un cambio de volumen brusco por
la deshidratación (distorsión del tejido), se
aplica una serie gradual de soluciones de
alcohol de menor a mayor concentración,
Por ejemplo: iniciando con alcohol al 50%,
luego con una solución al 60%, 70%, 80%, 90%
y alcanzando de manera paulatina el alcohol al
100% para lograr la deshidratación del tejido
ACLARAMIENTO
Consiste en introducir el tejido deshidratado en
una solución que sea miscible tanto con el alcohol
como con el medio de inclusión la parafina
La sustancia utilizada es el Xileno o Xilol que es
soluble en alcohol al 100%
Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna
transparente o claro en el Xileno, esto se debe a
que cambia su índice de refracción
El alcohol y el Xileno disuelven los lípidos de la
célula y por lo cual al extraerse también se
extraen las grasas y los lípidos de la célula
INCLUSION O IMPREGNACION
La inclusión es el método mas común de endurecer el
tejido y consiste en infiltrar la muestra con sustancias
liquidas que tras un proceso de polimerización o
enfriamiento se solidifican, sin afectar a las
características del tejido, esta sustancia es la parafina
Con ello se consigue obtener cortes delgados (desde
decenas de un a nm según el medio de inclusión) sin
que el tejido se rompa o se deteriore
Además es un buen método de preservar las muestras
durante largos periodos de tiempo. Existen diferentes
sustancias o medios de inclusión dependiendo del
grosor del corte y de la técnica que necesitemos realizar
INCLUSION O IMPREGNACION
La parafina liquida penetra al tejido al colocar la
amuestra del tejido en un recipiente y se le agrega
la parafina fundida 60ªC, colocando la muestra en
una estufa por 30 minutos a 6 horas manteniendo
la temperatura a 60ªC, la muestra es transferida a
través de tres baños sucesivos de parafina
Por el calor el Xilol se evapora y los espacios son
ocupados por la parafina
Posteriormente se coloca el tejido en un molde de
metal de forma rectangular y se espera que se
solidifique para formar un bloque solido de parafina
denominado taco
PASOS PARA OBTENCION DE LA
MUESTRA
SECCION O CORTE: Una vez que tenemos el taco se
puede cortar en secciones lo suficientemente
delgados (3 a 5 micrómetros) como para permitir el
paso de la luz
Para realizar el corte se utiliza un aparato llamado
Micrótomo
MONTAJE: Obtenidos los cortes todavía no son aptos
para su examen con el MO, puesto que los tejidos se
hallan en parafina y carecen de color
Se colocan en baño maría y se realiza el montaje en
un portaobjeto al que se agrega una pequeña
cantidad de albumina que actúa como adhesivo
SECCION O CORTE
MONTAJE
TINCION
Consiste en dar color a las diferentes estructuras de la célula.
Los colorantes en general se hallan disueltos en soluciones
acuosas
Previo a la tinción la muestra debe seguir un proceso previo
donde es necesario rehidratarlos, para lo cual se debe
eliminar la parafina y se incluyen en Xilol, y la muestra se
rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones
decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución de
agua
Ya rehidratado se tiñe al tejido. Los colorantes mas utilizados
son la hematoxilina colorante básico que tiñe de azul las
estructuras acidas de la célula y la eosina que tiñe de rosado
las estructuras básicas de la célula ( técnica Universal)
Desparafinizacion e hidratación: El portaobjeto con el corte pasa
de izquierda a derecha por dos cambios en xilol y luego por
alcoholes de dilución creciente hasta que se hidrata por
completo en el agua destilada. Luego se coloca el tiempo
necesario en el colorante (ultimo frasco de la derecha)
TINCION
Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que puede fijarse
de modo permanente el cubreobjetos con un medio adecuado para el
montaje( por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar)
Luego de la tinción en el o los colorantes, debemos obtener un
preparado permanente. Por lo tanto hay que quitarle el agua y
prepararlo para colocarle un cubreobjetos
En el Xilol el corte se aclara ( ya sabemos las propiedades del Xilol) y se
hace mas translucido y nítido en el MO. Pero aun debemos colocarle un
cubreobjetos para no dañar el corte con el objetivo del MO. El
cubreobjetos se adhiere al corte colocando una gota de bálsamo
sintético
Los medios de montaje pueden ser miscibles o no miscibles en agua, si
son miscibles en agua ya no es necesaria la deshidratación después del
teñido, se puede montarlo directamente. El cubre objetos no solo
protege el tejido , sino que se requiere para observar el corte con un
microscopio
Sin tincion- Con Eosina- Con
Hematoxilina
Una gota de balsamo es colocada sobre el corte teñido,
deshidratado y aclarado. Luego se coloca con cuidado
una fina lamina de vidrio (cubreobjetos) sobre el mismo
Protocolo común de inclusión
en parafina es el siguiente
