ESPECTROFOTOMETRIA

ESPECTROFOTOMETRI
A
Dr. BENJAMIN ANGARITA
OBJETIVOS DE LA PRACTICA

 Definir Espectrofotometría
 Definir Fotocolorimetría
 Explicar la Naturaleza de la LUZ
 Explicar la Teoría Corpuscular de la LUZ
 Explicar la Teoría Ondulatoria de la LUZ
 Explicar la Ley de Lambert
 Explicar la Ley de Beer
 Explicar la LEY de Lambert-Beer.
 Como funciona un Espectrofotómetro.
 Estandarización de un Método Espectrofotométrico
 Obtener la curva espectral de una muestra coloreada.
 Construir la curva de calibración.
 De acuerdo con la curva de calibración encontrar la concentración de una muestra desconocida.
  
  
 ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis

más usados, y se basa en la medición de la relación
que existe entre la absorción de luz (energía radiante)
por parte de un compuesto y su concentración en
función de una determinada longitud de onda.
Es el método de análisis óptico más usado en
las investigaciones químicas y bioquímicas.
 ESPECTROFOTOMETRIA

 Es una técnica analítica que permite determinar la

concentración de un compuesto en solución .

 Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones

electromagnéticas y a su ves que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentración.
 ESPECTROFOTOMETRIA
 La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se
basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz
monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio
homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y
otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea
atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la
intensidad del rayo de luz transmitido.
 PRINCIPIOS dela Espectrofotometría
 En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona
del ultravioleta y visible del espectro.
 La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición
del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante.
 En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda
utilizada.
 La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de
las moléculas, y es característica de cada sustancia química.
 APLICACIONES DE LA
ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE Y
ULTRAVIOLETA
La espectrofotometría es de gran utilidad en el análisis de sustancias químicas sobre todo
para el químico analítico.

 En bioquímica se utiliza por ejemplo para:

 1. Identificar compuestos por su espectro de absorción.

 2. Conocer la concentración de un compuesto en una disolución.

 3. Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de análisis químico.

 4. Seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas.

 Espectrofotómetro

 El espectrofotómetro es un instrumento que permite

comparar la radiación absorbida o transmitida por una
solución que contiene una cantidad desconocida de soluto,
y una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia.
FOTOCOLORIMETRIA

 Método que sirve para hallar concentraciones de

sustancias diferentes en muestras coloreadas.
 Consiste en medir la intensidad de luz absorbida o
trasmitida por una solución coloreada del compuesto.
 El fundamento de la fotocolorimetria se debe a la capacidad
de las moléculas para absorber radicales.
 Espectrofotómetro
La luz de una lámpara de características especiales es
guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa
luz de una determinada longitud de onda 8
Monocromador) y la hace pasar por una muestra
( Incidencia).
La intensidad de la luz que sale de la muestra
(Transmitancia) es captada y comparada con la intensidad
de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se
calcula la ABSORBANCIA de la sustancia en la muestra,
que depende de factores como la concentración de la
sustancia.
•Fuente de luz: ilumina la muestra, generalmente son lámparas de tungsteno o de xenón.
•Monocromador: aísla las radiaciones de longitud de onda deseada. Se usa para obtener luz
monocromática.
•Fotodetectores: percibe la señal de múltiples longitudes de onda (hasta 16) simultáneamente.
COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO

1. Fuente de luz
2. Rendija de entrada
3. Monocromadores
4. Rendija de salida
5. Cubeta
6. Detector
7. Medidor
Fotones: partículas responsable de las manifestaciones
cuánticas del fenómeno electromagnético
 Cuidados
 Coloque el instrumento en un lugar en donde no esté sujeto a
vibraciones, calor excesivo, humedad o luz directa.
 Proteja el instrumento del polvo. Nunca toque las superficies
ópticas tales como lentes y filtros. Siga las instrucciones que da el
fabricante para la limpieza de tales componentes.
 Permita que el instrumento se caliente antes de hacer algún
procedimiento.
 Verifique el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas
y cuando varíe la longitud de onda.
 Asegúrese de que las cubetas estén limpias y libres de ralladuras
y huellas digitales. Esto debe hacerse cada vez que va a usarse.
 APLICACIONES DE LA
ESPECTROFOTOMETRÍA VISIBLE Y
ULTRAVIOLETA
La espectrofotometría es de gran utilidad en el análisis de sustancias químicas sobre todo
para el químico analítico.

 En bioquímica se utiliza por ejemplo para:

 1. Identificar compuestos por su espectro de absorción.

 2. Conocer la concentración de un compuesto en una disolución.

 3. Determinar la glucosa en sangre en un laboratorio de análisis químico.

 4. Seguir el curso de reacciones químicas y enzimáticas.

 TEORIAS QUE EXPLICAN EL
COMPORTAMIENTO DE LA LUZ

A mediados del XVII cuando aparecen casi conjuntamente

dos teorías acerca de la naturaleza de la luz. Teoría
CORPUSCULAR (1666) y teoría ONDULATORIA (1678)
TEORIA CORPUSCULAR
 TEORIAS SOBRE EL ORIGEN
DE LA LUZ

 Teoría corpuscular

 Newton descubre en 1666 que la luz natural, al pasar a través de un prisma es

separada en una gama de colores que van desde el rojo al azul. Newton concluye
que la luz blanca o natural está compuesta por todos lo colores del arcoíris.

   Supone que la luz está compuesta por una granizada de corpúsculos o

partículas luminosos, los cuales se propagan en línea recta , pueden atravesar
medios transparentes y ser reflejados por materias opacas.
Para plantear esta teoría Newton tomo en
cuenta las siguientes evidencias:
1. Cuando un obstáculo se interpone en el
camino de la luz se producen sombras.
2. Las sombras de los objetos mantienen la
forma de ellos, por lo que la luz se propaga
en línea recta.
3. La luz puede reflejarse rebotando en los
objetos, lo que nos permite ver objetos que
no emiten luz propia
 Establecía que la luz estaba formada por
pequeñas partículas (corpúsculos) que eran
emitidas desde las fuentes luminosas, y que
estas partículas viajaban en línea recta a
muy alta velocidad. Esta teoría lograba
explicar satisfactoriamente los fenómenos de
las sombras, la reflexión y la refracción de la
luz.
Naturaleza de la luz.
 La luz es de doble naturaleza: corpuscular y ondulatoria.
 En base a su carácter ondulatorio la luz se comporta como una
onda y cumple las leyes que rigen los movimientos
ondulatorios. Según esto puede ser relejada, refractada,
transmitida.
 Cada radiación luminosa se caracteriza por una frecuencia (v)
y una longitud de onda (λ)

 V= c / λ
 En razón a su naturaleza corpuscular la luz se considera formada por cuantos o
paquetes de energía que se desplazan con movimiento ondulatorio.
 Al incidir un rayo luminoso de determinada frecuencia sobre un cuerpo se pueden
producir cambios en el que solo se lograría con la aplicación de energía lo que
produce un desprendimiento de electrones; este fenómeno es conocido como
EFECTO FOTOELECTRICO y sirve para medir la intensidad de las radiaciones
electromagnéticas, ultravioletas, visibles o infrarrojas.
 En conclusión: 

La teoría corpuscular  dice que las partículas no

se mueven como ondas, sino que se mueven a
manera de un cuerpo común, es decir, en línea
y con una trayectoria bien definida 
TEORIA ONDULATORIA
 TEORIA ONDULATORIA

 Christian Huygens 1678

 Describe y explica lo que hoy se considera como leyes de

reflexión y refracción. Define a la luz como un movimiento
ondulatorio semejante al que se produce con el sonido.
 Teoría electromagnética
 Fue desarrollada por quien es considerado el más imaginativo delos
físicos
 teóricos del siglo XIX, nos referimos a James Clerk Maxwell (1831-
1879).
 En la descripción que hace de su propuesta, Maxwell propugna que
cada cambio del campo eléctrico engendra en su proximidad un campo
magnético, e inversamente cada variación del campo magnético origina
uno eléctrico. Dado que las acciones eléctricas se propagan con velocidad
finita de punto a punto, se podrán concebir los cambios periódicos -
cambios en dirección e intensidad - de un campo eléctrico como una
propagación de ondas. Tales ondas eléctricas están necesariamente
acompañadas por ondas magnéticas indisolublemente ligadas a ellas.
 La luz no viaja en línea recta exactamente, sino
que la luz está compuesta de unos cuantos
fotones, que son liberados por los átomos
cuando uno de sus electrones pasa a su nivel
inferior de energía.
Estos fotones viajan en varias frecuencias
distintas lo que produce luz de diferentes
colores.
 Espectro visible

Se llama espectro visible a la región

del espectro electromagnético que
el ojo humano es capaz de percibir.
A la radiación electromagnética en
este rango de longitudes de onda se
le llama luz visible o
simplemente luz.  
Los arcoíris son un ejemplo de
refracción del espectro visible.
 ESPECTRO VISIBLE

 Se denomina espectro visible a la región del ESPECTRO

ELECTROMAGNETICO  que el OJO  humano es capaz de percibir.

 A la radiación electromagnética en este rango de longitudes de onda se le

llama luz visible o simplemente LUZ.

 No hay límites exactos en el espectro visible; un típico ojo humano responderá

a LONGITUD DE ONDA  desde 400 a 700  nm aunque algunas personas
pueden ser capaces de percibir longitudes de onda desde 380 a 780 nm.
Un rayo luminoso puede estar formado por radiaciones de una sola longitud
de onda o por un conjunto de ellas de diferentes longitudes.

MONOCROMATIC POLICROMATICO
O
¿QUÉ ES UN ESPECTRO VISIBLE?
 COLORES DEL ESPECTRO


 Los colores del ARCO IRIS   en el espectro visible incluye todos esos colores
que pueden ser producidos por la luz visible de una simple longitud de onda, los
colores del espectro puro o monocromáticos.

 A pesar que el espectro es continuo y por lo tanto no hay cantidades vacías

entre uno y otro color, los rangos anteriores podrían ser usados como una
aproximación.
 VISION DEL COLOR
El color es la impresión producida por un tono de luz en los órganos visuales, o más
exactamente, es una percepción visual que se genera en el cerebro de los humanos y otros
animales al interpretar las señales nerviosas que le envían los fotorreceptores en la retina del
ojo, que a su vez interpretan y distinguen las distintas longitudes de onda que captan de la
parte visible del espectro electromagnético.
 Los ojos de muchas ESPECIES perciben longitudes de onda
diferentes de las del espectro visible del ojo humano.

 Por ejemplo, muchos INSECTOS , tales como las ABEJAS  pueden ver la

luz ultravioleta que es útil para encontrar el néctar en las flores.

 Por esta razón, los éxitos reproductivos de las especies de plantas cuyos
ciclos de vida están vinculados con la polinización de los insectos,
dependen de que produzcan emisión ultravioleta, más bien que del
colorido aparente a los ojos humanos.
 Un rayo luminoso puede estar formado por radiaciones de una
sola longitud de onda ( luz monocromatica) o por un conjunto de
radiaciones de diferentes lonjitudes (luz policromatica)
MILIMICRAS COLOR OBSERVADO

400 Violeta (mezcla rojo y azul)

440 Azul

470

565 Verde (mezcla azul y amarillo)

590 Amarillo

615 Anaranjado (mezcla de amarillo y

rojo)

700 Rojo
 LEY DE LAMBERT BEER

Johann Lambert

Pierre Bouguer August Beer


LEY DE LAMBERT – BEER

 Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de

 longitud de onda fija) y concentración de un cromoforo en solución.

 A = log l/lo = a.C.L

 La absorción de la luz por una solución coloreada depende de la intensidad del

rayo incidente. A mayor intensidad de luz incidente mayor será la intensidad de la
luz transmitida.

 A la relación de la luz transmitida y la luz incidente se le denomina

TRANSMITANCIA
 LEY DE LAMBERT

 Si l es el trayecto de la cubeta que atraviesa la luz a través de la cubeta que contiene a la

solución, podemos observar que al aumentar l aumentara el numero de centros, en
consecuencia la luz absorbida va a ser mayor.

 Por consiguiente la :

 Absorbancia es directamente proporcional a la longitud de la cubeta.

 El numero de centros es proporcional a l, el numero de centros entonces también es

proporcional a As.
 LEY DE BEER

 La ley de BEER afirma

que la cantidad de luz
absorbida por una
Solucion depende de la
concentración de la
misma..

La Absorbancia es directamente proporcional a

Concentracion
 Esta ultima relación es a que se denomina ABSORTIVIDAD y es característica
de cada sustancia dependiendo la longitud de onda, temperatura, etc.

 A es directamente proporcional a la Concentración

 A es directamente proporcional a la Longitud de la Cubeta

 Por lo tanto: A es directamente proporciona a CONCENTRACION X

Longitud Por lo tanto : A= ExlxC

 Corresponde a la ley de Lambert – Beer y es la base de todo análisis

espectrofotométrico.
Esta relación puede ser expresada como:

A = εCL
Donde:

o A = Absorbencia
o ε = Coeficiente molar de extinción
o d = Distancia en cm
o c = Concentración molar
 As= e CL
•E= absortividad molar. Cuando
la concentración está en mol/L
Es una propiedad de la materia
relacionada únicamente con la
naturaleza de la misma

•L= trayectoria de la radiación a

través de la muestra (cm)

•C= concentración (mg/L o mol/l)

 METODO
ESPECTROFOTOMETRICO
 Cualquier solución coloreada presenta una absorción en el
rango visible, pero esto no indica que cumpla la ley de Beer.

 Para determinarlo, se debe averiguar la longitud de onda de máxima

absorción.

 En este procedimiento se hacen lecturas de As (absorbancia) o

% T a diferentes longitudes de onda, a concentración constante
 Estandarización de un método
espectrofotométrico

Para Estandarizar un Método Espectrofotométrico:

1. Preparar los tubos de Trabajo
2. Realizar una CURVA ESPECTRAL
3. Realizar una CURVA DE CALIBRACION
 La longitud a la cual se presenta la máxima absorbancia o la mínima
transmitancia se determina por la observación de datos o por una curva de
As vs. λ denominada CURVA ESPECTRAL.

 Habiendo conseguido la longitud de onda de máxima absorción ( λ max), se

determina la As de diferentes concentraciones a esta longitud y se grafica
entonces As vs. C denominada CURVA DE CALIBRACION.

 Si la curva resultante es una recta se dice que la solución sigue la ley de

lambert – Beer en ese rango de concentraciones.
 Esta ultima relación es a que se denomina ABSORTIVIDAD y es
característica de cada sustancia dependiendo la longitud de onda,
temperatura, etc.

 As = E x l x C

 si l se expresa en cm y C en gr/lt, entonces:

 As = E x l x C

 Corresponde a la ley de Lambert – Beer y es la base de todo análisis

espectrofotométrico.
Estandarización de un método espectrofotométrico

El método de estandarización consiste en la corrida de loa resultados

necesarios para determinar los parámetros de estandarización

MATERIALES

Cubetas para lectura

HCL 0.1N -pipetas de 10.5 y 1ml
Tubos de ensayo
Espectrofotómetros o colorímetros
NaOH 0.1N
Solución de rojo de fenol 2.5 mg&
 TUBOS DE TRABAJO

No. INSUMO Tubo de Ensayo No, 1 Tubo de Ensayo No, 2 Tubo de Ensayo No, 3 Tubo Blanco

-
1 ROJO DE FENOL 2.5% 5ml 2.5 ml 1ml

5 ml
2 AGUA DESTILADA .- 2.5 ml 4 ml

0.1 ml
3 ACIDO CLORIDRICO 0.1 N 0.1 ml 0.1 N 0.1 ml

 
4        
 CURVA ESPECTRAL

Para determinar si la solución cumple con la ley de Beer se debe averiguar la longitud de onda de máxima absorción.
En este procedimiento se hacen lecturas de As o %T a diferentes longitudes de onda, a concentración constante.
La longitud a la cual se presenta máxima absorbancia o mínima transmitancia se determina por la observación de datos o por una curva de As vs λ
que se denomina curva espectral.
Para tal fin se trabajan con el Tubo 1 y el Tubo B
El Tubo B es para Calibrar el Espectrofotometro
Al Tubo 1 le medimos con el Espectrofotómetro la ABSORBANCIA a:
400-420-440-460-480-500-520-540-560-580-600-620-640 nm
Calibrando el aparato con el Tubo B en cada medida
ESPECTROFOTOMETRO
Que es la curva de calibración?

• La curva de calibración es un método muy utilizado en química

analítica para determinar la concentración de una sustancia
(analito) en una muestra desconocida, sobre todo en disoluciones.

• El método se basa en la relación proporcional entre la

concentración y una determinada señal analítica (propiedad).

• Conociendo esta relación, será posible conocer la concentración en

una muestra dada mediante la medida de esa señal. La relación
concentración – señal se suele representar en una gráfica a la que
se le conoce como curva de calibración o curva de calibrado.
Curva de calibración
Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una
muestra problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de
calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco
soluciones de estándar o patrones de concentraciones conocidas, con la
absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ max)

A=mc+n
Elaboración de una curva de calibración

Para elaborar una curva de calibración lo primero es

colocar en el Equipo La Longitud de Onda Máxima
hallada en la Curva Espectral y se utilizan los 4 Tubos.de
Soluciones con una concentración conocida de analito (la
sustancia a medir).

Estas Soluciones se conocen como Soluciones patrón

(1,2 y 3). Se han de elaborar una batería de patrones
suficiente para cubrir un rango que incluya la
concentración esperada en las muestras desconocidas.

Las concentraciones utilizadas en los patrones también

han de estar dentro del rango válido para la
técnica analítica que se va a utilizar.

Es decir, han de estar por encima del mínimo de

concentración de analito cuantificable por la técnica
utilizada
La curva de calibrado se construye midiendo la señal analítica en cada uno de los
patrones previamente elaborados.
En el eje de ordenadas se asigna el valor de la señal medida y en el eje de abscisas la
concentración del patrón.
De esta forma podemos señalar puntos en la gráfica según las coordenadas
(concentración (x), señal (y)).
CURVA DE CALIBRACIÓN
GRACIAS