Las células B inducidas naturalmente durante la infección

por el virus del dengue liberan CD27 soluble, cuyo nivel

plasmático se asocia con formas graves de dengue pediátrico.
 Introducción
• El dengue es una importante enfermedad viral transmitida por vectores en todo el mundo que se transmite por mosquitos del  género Aedes y es responsable de una carga anual de 390 millones de infecciones, 90 millones de las
cuales son sintomáticas ( Bhatt et al., 2013 ). La enfermedad, que se debe a la infección con uno de los cuatro serotipos virales relacionados antigénicamente , varía clínicamente de asintomática a enfermedad potencialmente
mortal. La inmunidad juega un papel fundamental tanto en la protección como en la patogénesis del dengue (  Simmons et al., 2012 ), siendo los anticuerpos neutralizantes el principal mecanismo de protección ( 
Murphy y Whitehead, 2011).). Sin embargo, los anticuerpos heterotípicos no neutralizantes o subneutralizantes se asocian con un aumento de la  carga viral celular a través de un mecanismo conocido como 
potenciación dependiente de anticuerpos ( Halstead y O'Rourke, 1977 ). Por tanto, la mayoría de los casos de dengue grave se presentan en pacientes con infecciones secundarias ( Rothman, 2004 ).
• La infección por el virus del dengue (DENV) induce un aumento masivo de los plasmoblastos circulantes específicos del dengue durante la fase aguda, especialmente en las infecciones secundarias. Esta respuesta está dominada en
gran medida por plasmablastos que expresan IgG, con alta reactividad cruzada entre los cuatro serotipos. Cuando se analiza al comienzo de la fase aguda, la frecuencia de plasmablastos puede llegar al 40% del total de linfocitos
circulantes ( Wrammert et al., 2012,Zompi et al., 2012). Los plasmablastos expresan de forma característica niveles altos de los antígenos CD27 y CD38 en la superficie celular, y ambos antígenos se utilizan ampliamente para la
caracterización fenotípica por citometría de flujo (FC) o microscopía de fluorescencia (Sanz et al., 2008 ). CD27 es un miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), cuya expresión está restringida a los
linfocitos. La interacción de CD27 con su receptor análogo CD70 desencadena la señalización de NF-κB en las células T , lo que influye en la supervivencia celular y la diferenciación celular ( Borst et al., 2005 ). CD38 , una 
ADP ribosa hidrolasa de superficie celular con propiedades ectoenzimáticas multifuncionales, se expresa mediante precursores de linfocitos, células T y B activadas y células no hematopoyéticas (  Malavasi et al., 2008 ). La
interacción CD38-CD31 da como resultado un aumento de Ca ++ intracelularmovilización y respuestas proliferativas en determinadas células, como las células B (  Deaglio et al., 1996 ). Por tanto, el aumento de la expresión de CD27
y CD38 en linfocitos se ha utilizado como marcador de activación inmunitaria durante la enfermedad.
• Las formas solubles de ambos marcadores se encuentran en los fluidos corporales como el plasma.  Durante el acoplamiento del complejo receptor de linfocitos T (TCR) -CD3, los linfocitos T humanos aumentan fuertemente la
expresión y liberación de CD27 en la membrana in vitro ( Hintzen et al., 1991 ). Por lo tanto, la liberación y el mantenimiento de los niveles plasmáticos de CD27 soluble (sCD27) y CD38 soluble (sCD38) se atribuyen en gran medida a
las células T activadas ( Borst et al., 2005 , Malavasi et al., 2008 ). Sin embargo, sCD27 está presente en niveles marcadamente más altos en el sobrenadante de células T y B humanas primarias estimuladas cocultivadas que en el
sobrenadante de células T cultivadas solas ( Bohnhorst et al., 2002 ). Además, los niveles altos de sCD38 son detectables en suero oascitis de pacientes con mieloma múltiple , una enfermedad caracterizada por la presencia de
células plasmáticas neoplásicas (Mehta et al., 1996). Por lo tanto, las células B humanas activadas, además de las células T, podrían ser una fuente de sCD27 y sCD38 en estados de salud y enfermedad.
• Los niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38 se han utilizado para monitorear y rastrear la actividad de enfermedades autoinmunes (  Bohnhorst et al., 2002 , Funaro et al., 1996 ), enfermedades neoplásicas malignas ( 
Huang et al., 2013 , Ibrahim et al., 2001 ), trasplante de riñón ( Hamer et al., 2010 ) y algunas infecciones virales ( De Milito et al., 2002 , Atlas et al., 2004 ). Por ejemplo, durante la infección por VIH , el aumento de sCD27 en
plasma se asocia con una carga viral alta, recuentos absolutos bajos de células T CD4 + y una progresión más rápida hacia la inmunodeficiencia. La introducción deLa terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) disminuye
rápidamente los niveles plasmáticos de sCD27 y el cese de la terapia coincide con la restauración de los niveles plasmáticos elevados de este marcador (  Atlas et al., 2004 ). También se han encontrado cantidades detectables de
sCD38 funcional en fluidos biológicos y en sobrenadantes de cultivo de células T aloestimuladas,  líneas celulares linfoblastoides y células B humanas ( Funaro et al., 1996 , Mallone et al., 1998 ). Por lo tanto, se ha demostrado que
sCD27 y sCD38 son biomarcadores adecuados para numerosas afecciones inflamatorias en humanos.
• Aquí, evaluamos la liberación de sCD27 y sCD38 a partir de células B activadas generadas después de la estimulación policlonal  in vitro o inducida naturalmente por el dengue, otra enfermedad viral para la que se ha descrito una
importante actividad inmune e inflamación. Para determinar los efectos sobre el compartimento sistémico y la posible relación con el resultado clínico, también se analizaron los niveles de sCD27 y sCD38 en el plasma de niños
sanos y niños con infección por DENV (durante las fases aguda y convaleciente) que oscilaron clínicamente de leve a grave.
• 2 . materiales y métodos
• 2.1 . Temas y muestras
• Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Surcolombiana (código de aprobación: NCS-046) y el Hospital Universitario de Neiva (código de aprobación: HUN-031).  Se obtuvo el consentimiento informado por
escrito de los padres y el asentimiento informado (para niños mayores de 6 años) para cada uno de los niños incluidos. Todos los experimentos siguieron los principios expresados ​en la Declaración de Helsinki.
• Este estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Infección e Inmunidad de la Universidad Surcolombiana y el Hospital Universitario de Neiva, Colombia.  Los pacientes y niños sanos se inscribieron desde enero de 2011 hasta marzo
de 2014. Se incluyeron dos grupos de niños, entre 1 y 14 años de edad: sanos (n = 15) e infectados por  DENV (n = 63).
• El grupo sano incluyó a niños de la escuela primaria “Promoción Social” sin signos o síntomas actuales de enfermedad, según lo determinado por el examen físico realizado por el Servicio de Pediatría del Hospital Universitario de
Neiva, incluyendo hemograma completo . Los niños con infección por DENV se clasificaron clínicamente de acuerdo con las directrices revisadas de la OMS de 2009 (  
Organización Mundial de la Salud - DSG apoyado por la Unión Europea, 2009 ) en niños sin signos de advertencia (dengue, n = 17), dengue con signos de advertencia (DW, n = 35) y dengue severo (DE, n = 11).
• Se recolectaron muestras de 2 a 4 ml de sangre venosa total ( DSG apoyado por la Unión Europea de la Organización Mundial de la Salud, 2010 ) en tubos con EDTA (BD Vacutainer®, San Jose, CA; cat: 367861) y se centrifugaron
durante 10 min a 300 × g . El plasma se separó y se almacenó a -70 ° C para su uso posterior. Para los niños con dengue, la muestra se tomó durante la fase aguda (3-6 días después del inicio de los síntomas).  Se tomó una segunda
muestra de los niños con dengue (n = 35) 15 a 27 días después del inicio de los síntomas (la fase de convalecencia).   
 Metodología
• 2.2 . Diagnóstico de la infección por DENV
• La infección por el virus del dengue se confirmó mediante la
presencia de inmunoglobulina (Ig) M específica de DENV y / o la
proteína no estructural viral 1 (NS1) mediante un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando un kit
comercial (Panbio®, Alere, Australia). ; cat: E-DEN01M y E-
DEN02P, respectivamente) siguiendo las instrucciones del
fabricante. También se evaluó la IgG específica de DENV en plasma
utilizando un kit ELISA de captura comercial (Cat: E-DEN02G). Para
determinar el tipo de infección (primaria frente a secundaria), se
utilizó la relación IgM / IgG específica de DENV en plasma. Como se
informó anteriormente, una proporción de menos de 2 se consideró
una infección secundaria (Innis et al., 1989).
• 2.3 . Serotipado DENV
• El serotipo infectante se determinó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa convencional específica
de DENV (RT-PCR) siguiendo un protocolo previamente informado, con modificaciones menores ( Lanciotti et al., 1992 ). En
resumen, el ARN viral se aisló utilizando un kit de ARN viral QIAamp (QIAGEN, Valencia, CA, Cat: 52906) siguiendo las
instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se determinó utilizando un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific In, Waltham,
MA) y  se obtuvo  una mediana (rango) de 89 ng / μL (75-120). Para la RT-PCR convencional , se mezclaron 10 μL de ARN aislado
con 1 μg / μL de cebador D2 durante 5 min a 72 ° C, seguido de incubación en hielo durante 5 min. El ARN viral objetivo se convirtió
en ADN complementario (ADNc) usando RT-Mix (todos los reactivos de Promega Corp, Madison, WI) que contenían 5 U de 
transcriptasa inversa AMV (Cat: M5108),  ditiotreitol 0.01 M (DTT, Cat: P1171), 10  Trifosfatos de desoxinucleótidos mM (dNTP,
Cat: U1511) y 10 U RNasin (Cat: N2511). El cDNA obtenido se diluyó 1: 5 y  se añadieron 2,5 μL a 22,5 μL de PCR Nucleotide Mix
(Promega Corp, Madison, WI; Cat: M8295) que contenía KCl 50 mM, Tris 10 mM (pH 8,5), Triton X al 0,1%. -100 , gelatina al
0,01%, 2,5 mM (dNTP), MgCl 2 1,5 mM , 5,5 U / μL     Taq DNA polimerasa y  cebadores D1 y D2 de 1 μg / μL (Integrated DNA
Technologies, Inc, Coralville, IA). El producto obtenido se diluyó 1: 100 y se agregaron5μL a 30 μL de mezcla de nucleótidos de PCR
que contenía 1 μg / μL de cebadores D1, TS1, TS2, TS3 y TS4 (Integrated DNA Technologies, Inc, Coralville, IA). Las secuencias de
los cebadores utilizados fueron las siguientes: D1, 5'-TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G-3 '; D2, 5'-TTG CAC CAA
CAG TCA ATG TCT TCA GGTTC-3 '; TS1, 5'-CGT CTC AGT TGA TCC GGG GG-3 '; TS2, 5'-CGC CAC AAG GGC CAT GAA
CAG-3 '; TS3, 5'-TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C-3 '; TS4, 5′-CTC TGT TGT CTT AAA CAA GAG A-3 ′. Se utilizaron como
controles negativos y positivos, respectivamente, agua libre de ARNasa y lisados ​celulares previamente caracterizados para cada
serotipo viral. RT y La PCR anidada se realizó utilizando un termociclador Veriti (Applied Biosystem, Waltham, MA), con el siguiente
perfil térmico: 42  ° C durante 60 min y 95 ° C durante 5 min para RT-PCR; 95 ° C durante 60 s, 40 ciclos de amplificación a 94 ° C
durante 45 s, 60 ° C durante 45 sy 72 ° C durante 1 min y una extensión final a 72 ° C durante 7 min para PCR anidada. Los productos
y la escalera de ADN GeneRuler 1Kb (Thermo Scientific In, Waltham, MA; Cat: # SM0311) se sometieron a electroforesis en un 
gel de agarosa al 2% (Bioline Reagents, London; Cat: BIO-41025) durante 2 ha 110ºC.   V. Los resultados se analizaron usando un
sistema Molecular Imager Gel Doc ™ XR + y el software Image Lab ™ (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA).
• 2.4 . Aislamiento de PBMC
• Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante 
gradiente de densidad de Ficoll (Ficoll-Hypaque GE Healthcare, Piscataway, NJ;
Cat: 17-1440-02), dentro de las primeras 4   h después de la flebotomía. Para
ello, la sangre venosa periférica se diluyó 1: 2 en
 solución salina tamponada con fosfato 1X estéril(PBS [Gibco®, Carlsbad, CA;
Cat: 70-013-032]), se añadió a tubos Ficoll y se centrifugó durante 30 min a 300
×gy temperatura ambiente. Después de la centrifugación, las PBMC se
recolectaron y lavaron dos veces con RPMI-1640 suplementado con 
suero bovino fetal (FBS) al 10% , L-glutamina2nM, 100U / ml de penicilina y
100  μg / ml de estreptomicina (todos los reactivos de Gibco®, Carlsbad, CA,
medios completos). En todos los experimentos, la viabilidad celular se determinó
mediante la prueba de exclusión con azul tripán (Merck, Darmstadt, Alemania;
Cat: 111732), con una mediana (rango) del 94% (86-98) de células viables.
• 2.5 . Purificación y cultivo de células B
• Las células B humanas se purificaron mediante selección inmunomagnética positiva. Las PBMC se lavaron, se
resuspendieron en tampón de separación ( albúmina de suero bovino al 0,5% [BSA, Sigma-Aldrich®, St. Louis,
MO; Cat: A7906],  EDTA 2 mM [Gibco®, Carlsbad, CA; Cat: 15.575-038] en PBS 1X desgasificado) y se
incubaron con microperlas magnéticas acopladas a anti-CD19 (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA; Cat: 130-
050-301) durante 15  min a 4-8  ° C. Después de la incubación, la suspensión celular (1 x 107 células en 500  μl
de tampón de separación) se pasó por una columna LS (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA; Cat: 130-042-
401). Luego, las células B (CD19 +) y la fracción de PBMC empobrecida en células B (dPBMC, que contiene
las células T) se recuperaron, lavaron y contaron. Después de la purificación, la mediana y el rango de células 
CD19 + fue del 92% (90-97%). En la fracción dPBMCs, la eficiencia del agotamiento de las células CD19 + fue
superior al 80% según lo determinado por FC.
• Células B y dPBMCs se incubaron a una densidad de 2 x 10 6 células / ml para 96  h en medio completo a 37  °
C y 5% de CO 2 . En algunos experimentos, se estimularon células B purificadas de niños sanos con 10  ng / ml
de IL-2 recombinante humana (R&D, Minneapolis, MN, Cat: 202-IL / CF), 5 μg / ml de CpG ODN 2006
(Invivogen, San Diego , CA: Cat: tlrl-2006) y 10 μg / ml de anti-IgA humana, IgG e IgM F (ab ') 2 de cabra
(anti- receptor de células B [BCR], Jackson ImmunoResearch®, West Grove, PA; Cat : 109-006-064),
condiciones que promueven la diferenciación de plasmablastos ( Narvaez et al., 2010 ). Después del cultivo, los
sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -20   ° C para la posterior determinación de los niveles de
sCD27 y sCD38 mediante ELISA. En todos los experimentos, la viabilidad celular se evaluó al final del cultivo
mediante tinción con azul tripán.
• 2.6 . Análisis de fenotipado de células B
• Las principales subpoblaciones de células B se evaluaron mediante FC multiparamétrica en PBMC completas
o en células B cultivadas in vitro purificadas . Las células B purificadas de niños sanos y niños con infección
por DENV se lavaron con 3 ml de tampón FACS (BSA al 0,5% [Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO; Cat:
A7906] y azida sódica al 0,02% [Merck, Darmstadt, Alemania ; Cat: 106688] en 1X PBS), y se agregaron los
siguientes reactivos en condiciones óptimas: anti-CD19 APC (clon HIB19, Cat: 555415), anti-CD20 APC-
Cy7 (clon L27, Cat: 335794), anti- CD27 PE (clon M-T271, Cat: 555441), anti-CD38 PerCp-Cy5.5 (clon
HIT2, Cat: 551,400) y anti- IgD FITC (clon IA6-2, Cat: 555,778) (todos de BD ™, San Jose, CA). Las
células se incubaron durante 30  min a 4ºC, se lavaron con tampón FACS y se fijaron en paraformaldehído al
 1% (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA). La frecuencia relativa de las principales subpoblaciones
de células B se determinó a partir de las células CD19 + purificadas antes y después del cultivo. Se
identificaron cuatro subpoblaciones CD19 + : células B vírgenes (CD27 - IgD + ), células B de memoria
 conmutada (células mB, CD27 + IgD - ), células IgM + mB (CD27 + IgD + ) y plasmablastos
(CD27 hi CD38 hola ). La expresión de CD27 en células T en una fracción de niños con infección por DENV se
determinó durante las fases aguda y convaleciente (n = 5). Con este fin, las PBMC se tiñeron con anti-CD3
PerCPCy5.5 (clon SK7, Cat: 340949) y anti-CD27 BV421 (clon M-T271, Cat: 562513, BD Pharmingen)
siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Dentro de 1  h después de que se completó la tinción, las
células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto II usando el software DIVA v6.1.3 (BD ​™, San
Jose, CA). El análisis se realizó con FlowJo (TreeStar Inc., San Carlos, CA). Se adquirieron al menos
20.000 eventos CD19 + o CD3 + para su análisis.
• 2.7 . Detección de sCD27 y sCD38 en sobrenadantes de cultivos y en plasma
• Las concentraciones de sCD27 y sCD38 en plasma y sobrenadantes de cultivos celulares se determinaron mediante
ELISA utilizando kits comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante (eBioscience, Viena Austria, Cat:
BMS286INST y MyBioSource, San Diego, CA; Cat: MBS260587, respectivamente). Para sCD27, las muestras
diluidas 1: 2 en diluyente de muestra se agregaron por duplicado a placas de 96 pocillos que contenían anti-sCD27
humano, un anti-sCD27 humano conjugado con biotina y estreptavidina-HRP y se incubaron durante 3
ha  temperatura ambiente con agitación constante a 400  rpm. Después de seis lavados con tampón de lavado, las
placas se revelaron con 3,3 ', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) durante 10  min en la oscuridad y la reacción se detuvo
con la solución de parada incluida en el kit. Las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm usando 630  nm
como referencia (espectrofotómetro Multiskan FC [Thermo Scientific Inc., Waltham, MA]).
• Para determinar la concentración de sCD38, las muestras se diluyeron 1:20 en diluyente de muestra y se incubaron por
duplicado durante 90  min a 37 ° C en placas de 96 pocillos prerrevestidas con anticuerpos monoclonales humanos
anti-sCD38 y luego durante 60 min con biotinilado. anti-CD38. Después de lavar tres veces con tampón de lavado, se
añadió el reactivo enzimático conjugado durante 30 min a 37 ° C seguido de cinco lavados, y la placa se reveló con los
reactivos de color A y B (incluidos en el kit) en la oscuridad a 37 ° C hasta que apareció el color. Finalmente, la
reacción se detuvo con el reactivo de color C. La placa se leyó a 450 nm usando 630 nm como referencia.       
• Para todos los ELISA sCD27 y sCD38, el coeficiente de correlación de la curva estándar fue superior a 0,98 y la
variabilidad duplicada fue inferior al 10%. Las sensibilidades informadas de los kits sCD27 y sCD38 son 0,2 U / ml y
0,06 ng / ml, respectivamente. La densidad óptica (DO) media de los controles negativos (solo diluyente) a 450 nm fue
de 0,02. La concentración se obtuvo por interpolación de la DO de las muestras a la curva estándar usando 
regresión logística de cuatro parámetros en GraphPad Prism® versión 6.0.  
• 2.8 . análisis estadístico
• Los datos se presentan como medianas y rangos. Para los análisis
estadísticos se utilizó GraphPad Prism 6.0 (software GraphPad
Prism® versión 6.0 La Jolla, CA). Se usó la 
prueba de Mann-Whitney para analizar dos grupos independientes y
la prueba de Wilcoxon se usó para datos emparejados. Cuando se
analizaron más de dos grupos independientes, se utilizó la 
prueba de Kruskal-Wallis . Si el valor de p de Kruskal-Wallis era
<0,05, se seleccionó la prueba de comparación múltiple de Dunn,
según cada caso. Los grados de correlación entre variables se
determinaron con pruebas de Spearman. Se utilizó
 la prueba de Fisher para el análisis de frecuencia. En todos los casos
se consideró significativo un valor de p <0,05.
• 3 . Resultados
• 3.1 . Pacientes
• Este estudio incluyó a 15 niños sanos y 63 niños con dengue . No hubo diferencias en la edad entre los niños sanos y los que padecían
dengue, con una mediana (rango de 6,8 1 a 14 y 4,0 1 a 14) años, respectivamente (P = 0,147 prueba de Mann-Whitney). Los niños con
dengue fueron evaluados entre el tercer y sexto día del inicio de la fiebre, con una mediana de 4 días. Los niños incluidos en los grupos de
estudio fueron comparables en términos de género y raza (P ≥ 0,246, prueba de Fisher , datos no mostrados).
• 3.2 . Las células B humanas secretan sCD27 en condiciones de diferenciación de plasmablastos in vitro
• Para determinar si las células B humanas activadas secretan sCD27 y sCD38 in vitro , se cultivaron células B altamente purificadas de niños
sanos en ausencia o presencia de IL-2, CpG 2006 y anti-BCR (estímulos policlonales conocidos por promover la diferenciación de 
plasmablastos ). Al inicio y después de 96  h de cultivo, células B vírgenes (CD27 - IgD + ), células switch mB (CD27 + IgD - ), células IgM + mB
(CD27 + IgD + ) y plasmablast (CD27 hi CD38 hi) las frecuencias se evaluaron mediante FC, y los niveles de sCD27 y sCD38 en los
sobrenadantes de cultivo se midieron mediante ELISA en diferentes puntos de tiempo. Se encontró una baja frecuencia de plasmablastos
en cultivos de células B no estimuladas a las 0 y 96  h ( Fig. 1 A). Como era de esperar, el tratamiento con estímulos policlonales aumentó
significativamente la frecuencia de plasmablast pero no la de las otras poblaciones de células B ( Bernasconi et al., 2002 ). Al final del
período de cultivo, la mediana (rango) de frecuencias de plasmablastos en cultivos de células B no estimuladas a las 0 y 96 horas y en
cultivos de células B estimuladas a las 96 horas fueron del 3,7% (0,2-15), 5,1% (0,9-17 ) y 23,8% (1-39), respectivamente ( Fig.1A). De
acuerdo con el aumento de la frecuencia de plasmablastos, la concentración de sCD27 en el sobrenadante aumentó en cultivos de células
B estimuladas ( Fig.1 B) y se encontró una diferencia significativa entre el nivel de sCD27 detectado después de 96 h en cultivos de células
B estimulados y no estimulados. (P = 0,034, prueba de Mann-Whitney). Por el contrario, sCD38 no fue detectable por ELISA en los cultivos
bajo ninguna de las condiciones examinadas (datos no mostrados). En particular, la viabilidad de las células B, determinada por la tinción
con azul tripán al final del período de cultivo, fue superior al 80% y comparable en todas las condiciones analizadas (P = 0,102, 
prueba de Kruskal-Wallis , datos no mostrados), excluyendo la posibilidad de que estos resultados se debieran a diferencias en el grado de
muerte celular durante el cultivo. Por tanto, en condiciones de plasmablastos, las células B humanas liberan sCD27 pero no sCD38, y esto
está relacionado con el aumento de la frecuencia de plasmablastos.
Figura 1 . Las células B purificadas de niños
sanos y estimuladas policlonalmente in
vitro liberan sCD27 en el sobrenadante del
cultivo, y esto está relacionado con el aumento
de la frecuencia de plasmablastos . Las células
B de 15 niños sanos se purificaron mediante
selección positiva con microperlas magnéticas
anti-CD19 y se cultivaron (2 x 10 6 células /
ml) durante 96  h con o sin estímulos
policlonales. (A) Frecuencia de plasmablastos
( células CD27 hi CD38 hi activadas en CD19
 +
células) al comienzo y al final del cultivo
entre células con y sin estimulación fue
establecido por FC, como se muestra en el
recuadro. (B) Se evaluaron los niveles de
sCD27 en el sobrenadante del cultivo con y sin
estimulación a las 0 y 96 h mediante ELISA
 . Se muestra el valor P de la 
prueba de Mann-Whitney . 
• 3.3 . Las células B humanas activadas naturalmente por la infección por DENV liberan
espontáneamente sCD27, cuyos niveles se correlacionan con la frecuencia de plasmablast.
• La fuente de sCD27 en las enfermedades inflamatorias se ha atribuido tradicionalmente a las células T 
activadas ( Hintzen et al., 1991 , Huang et al., 2013 ). Sin embargo, los resultados anteriores muestran
que las células B humanas activadas in vitro también pueden secretar sCD27. Por lo tanto, buscamos
determinar si las células B de los niños activadas naturalmente por la infección por DENV y
enriquecidas en plasmablastos liberan espontáneamente sCD27 y sCD38. Con este fin, se cultivaron
células B altamente purificadas y dPBMC (la fracción que carece de células B pero que contiene células
T) aisladas durante la fase aguda de la enfermedad a densidades celulares iguales durante 96 h, y se
evaluó la liberación espontánea de sCD27 y sCD38 en el sobrenadante al final del cultivo. Las células B
y las fracciones de dPBMC de niños sanos también se incluyeron como controles.
• Como se muestra en la Fig. 2 A, las dPBMC y las células B purificadas de niños sanos produjeron
cantidades de sCD27 que fueron detectables al final del cultivo. De acuerdo con informes anteriores que
muestran que las células T son la principal fuente de sCD27 ( Hintzen et al., 1991 ; Huang et al., 2013 ),
las dPBMC de los niños con enfermedad de dengue secretaron las cantidades más altas del marcador
entre todas las condiciones evaluadas ( Figura 2 A). Como se predijo, las células B de los niños con
enfermedad del dengue liberaron cantidades significativamente más altas de sCD27 que las células B de
los niños sanos (P = 0,031, prueba de Mann-Whitney), lo que indica que las células B activadas
naturalmente pueden ser parcialmente responsables de la sCD27 en plasma.
purificadas de los niños con dengue
 enfermedad y se correlacionan con la
frecuencia de plasmablastos dentro del 
subconjunto de células B . Se obtuvieron
células B y dPBMC de niños sanos y niños
naturalmente infectados con DENV mediante
aislamiento inmunomagnético utilizando anti-
CD19 y luego se cultivaron (2 × 10 6 células /
ml) durante 96 h. (A) Después de cultivar,
sCD27 en los sobrenadantes de dPBMCs y B 
fracciones celulares se evaluó mediante ELISA
 . (B) Frecuencia de CD3 + CD27 + células por
CF en niños infectados por DENV durante las
fases aguda y convaleciente. Se muestra un
experimento representativo de cinco. (C) Para
determinar si las poblaciones de células B de
niños infectados con DENV se correlacionan
con sCD27 en el sobrenadante del cultivo, la
frecuencia relativa de los principales
subconjuntos de células B se evaluó mediante
FC usando anti- CD19 humano , anti-CD27,
anti-CD38 y anti- IgD
en células CD19 + purificadas , como se
muestra en cada gráfico superior izquierdo. Se
muestran los valores de p de las pruebas de
• Debido a que las dPBMC (posiblemente células T) eran la principal fuente de sCD27 en cultivo, queríamos establecer si la
frecuencia relativa de células T CD27 + se modifica por la infección por DENV en niños. Por lo tanto, la frecuencia
de células CD3 + CD27 + fue determinada por FC en niños con dengue tanto durante la fase aguda como convaleciente ( 
Fig. 2 B). Las frecuencias medias (rangos) de células CD3 + CD27 + en las fases aguda y de convalecencia fueron del 95%
(93-100) y 89% (82-93), respectivamente (P = 0,02, prueba de Mann-Whitney, datos no mostrados). Además, la intensidad
de fluorescencia media del antígeno CD27 fue significativamente mayor para las células T de los niños con dengue que para
las células T de los niños sanos, mediana (rango) 20,969 (14,481-24,588) y 15,446 (11,497-19,225), respectivamente ( P =
0,01 prueba de Mann-Whitney, datos no mostrados), lo que podría explicar el alto nivel de liberación de sCD27 por dPBMC
cultivadas de niños con dengue ( Fig. 2 A).
• Las células B de los niños con dengue pueden liberar sCD27 de forma espontánea ( fig. 2 A). Se sabe que las células B
humanas circulantes son heterogéneas y están compuestas por varias subpoblaciones. Para identificar la 
subpoblación de células B posiblemente responsable de la liberación de sCD27 en niños con enfermedad de dengue, se
determinaron células B vírgenes , células mB conmutadas, células IgM + mB y frecuencias de plasmablastos mediante FC al
final del cultivo, como se muestra en la Figura 2 C. De acuerdo con los resultados obtenidos con la estimulación in vitro de
células B purificadas ( Fig.1), la concentración de sCD27 se correlacionó positivamente con la frecuencia relativa de
plasmablastos al final del período de cultivo (rho = 0.58, P = 0.017) pero no con las células B vírgenes (rho = −0.40, P =
0.107), mB conmutado frecuencias de células (rho = 0.36, P = 0.159) o células IgM + mB (rho = 0.32, P = 0.221) ( Fig.2
C). El sCD38 también se evaluó en cultivo celular y, en todos los casos, los niveles estuvieron por debajo del límite de
detección del ensayo (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que esta subpoblación de células B humanas activadas,
particularmente aumentada en la enfermedad del dengue, puede liberar activamente sCD27 y, por lo tanto, puede contribuir,
al menos en parte, a los niveles plasmáticos de sCD27. Además, como se ha establecido para otras enfermedades infecciosas
inflamatorias, las células T pueden ser una fuente importante de sCD27 en la infección por DENV pediátrica.
• 3.4 . La infección natural con DENV induce selectivamente aumentos en sCD27 y
sCD38 plasmáticos en niños
• Los resultados anteriores demuestran que las células B y las dPBMC
(posiblemente células T) de los niños con enfermedad del dengue liberan
espontáneamente cantidades importantes de sCD27 pero no sCD38 ( Fig. 2
 A). Luego, buscamos determinar el impacto de esta secreción en el
compartimento sistémico. Para ello, se midieron mediante ELISA los niveles de
sCD27 y sCD38 en el plasma de niños sanos y con dengue. Como se muestra en
la Fig.3A, los niveles plasmáticos de sCD27 fueron significativamente más altos
en niños con enfermedad de dengue que en niños sanos (P = 0,002, prueba de
Mann-Whitney). Adicionalmente, los altos niveles observados en la fase aguda del
dengue disminuyeron significativamente durante la convalecencia (fase aguda vs
convaleciente: P <0.0001, prueba de Wilcoxon) a niveles comparables a los de los
controles sanos, resultado que apoya la idea de que este marcador es inducida
específicamente por la infección viral ( Fig. 3 A).
Figura 3 . La infección por el virus del dengue
 en los niños induce un aumento significativo
de las sCD27 y sCD38 plasmáticas. Los niveles
de (A) sCD27 y (B) sCD38 en el plasma de
niños sanos o con dengue durante
las fases aguda y de convalecencia (días 15-27
después del inicio de la fiebre) se determinaron
mediante ELISA . (CD) Cinética de los niveles
plasmáticos de sCD27 y sCD38,
respectivamente. Se muestra el número de
pacientes evaluados en cada día. (E) Se
evaluaron los niveles plasmáticos de sCD27 en
niños con infección por DENV primaria (1 °) o
secundaria (2 °) o en presencia de viremia /
antigenemia de la siguiente manera: [pos], NS1
y / o RT-PCRpositivos [neg], NS1 y RT-PCR
negativos. (F) Igual que (D) pero para
sCD38. Se muestran los valores de p de las
 pruebas de Mann-Whitney y Wilcoxon (en A –
B y E – F, según corresponda) y laprueba
de Kruskal-Wallis(C – D).
• Para sCD38, se encontró una diferencia significativa en el nivel plasmático en niños con dengue durante las fases aguda y de
convalecencia (P = 0,002, prueba de Wilcoxon), lo que respalda la idea de que la infección viral también modifica los niveles
plasmáticos de este marcador ( Fig.3 B) . Sin embargo, los niveles significativos en el estado estacionario y la gran variabilidad
en los niveles plasmáticos entre los niños sanos no nos permitieron establecer si también existían diferencias para el grupo con
enfermedad de dengue en fase aguda (P = 0,146, prueba de Mann-Whitney). El nivel trazado de sCD27 y sCD38 frente al día
de fiebre en el que se recogió la muestra reveló un pico para ambos marcadores en los días 5-6 después del inicio de la fiebre ( 
fig. 3 C y D). Es de destacar que estos son los días asociados con un alto riesgo de complicaciones del dengue.
• La activación inmunitaria aumentada se produce durante las infecciones secundarias por DENV ( Green et al., 1999 ), y los
niveles de sCD27 en plasma fueron consistentemente más altos en niños con infecciones secundarias en contraposición a las
primarias (P = 0,006, prueba de Mann-Whitney, Fig. 3 E). Aunque no alcanzó significación estadística, hubo una tendencia
hacia un nivel plasmático más bajo de sCD38 durante la infección secundaria ( Fig. 3 F), lo que apoya la idea de que este
marcador se comporta de manera inversa a sCD27 durante la infección por DENV.
• La liberación plasmática de sCD27 fue independiente de la presencia del virus o sus componentes en la circulación porque se
encontraron niveles plasmáticos más altos de sCD27 en aquellos niños con NS1 indetectable o genomas virales en su plasma (P
= 0,040, prueba de Mann-Whitney). Este resultado indica que la secreción de este marcador está mediada más por la activación
inmune que por la presencia del virus per se ( Fig. 3 E). Sin embargo, no hubo diferencias en el nivel de sCD38 en plasma entre
los niños con enfermedad de dengue con antigenemia NS1 y / o viremia indetectable ( Fig. 3 F). En este estudio, el serotipo
 infectante se identificó mediante [Link] el 60% de los niños infectados por DENV, y los niveles de sCD27 y sCD38
fueron comparables independientemente del serotipo infectante (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que la
infección con DENV induce selectivamente un aumento notable en los niveles plasmáticos de estos marcadores,
particularmente sCD27, durante la infección secundaria. Sin embargo, la presencia del virus en la circulación no es necesaria
para el aumento de los niveles plasmáticos de los dos marcadores durante la fase aguda de la infección.
• 3.5 . Los niveles plasmáticos inversos de sCD27 y sCD38 se correlacionan con la gravedad clínica
en la enfermedad pediátrica del dengue
• Debido a que la infección por DENV aumenta los niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38,
buscamos determinar si estos marcadores se correlacionan con la gravedad clínica de la
enfermedad. Con este fin, los niños con enfermedad de dengue fueron clasificados clínicamente y
por pruebas de laboratorio como dengue (n = 17), dengue con signos de alarma (DW, n = 35) o 
dengue grave (DE, n = 11). Como se muestra en la Tabla 1, no se encontraron diferencias
significativas entre los tres grupos cuando se analizaron la edad, el sexo y los días de enfermedad (P
= 0,082, prueba de Kruskal-Wallis; P = 0,342, prueba exacta de Fisher; y P = 0,856, prueba de
Kruskal-Wallis, respectivamente) . Como era de esperar, las infecciones secundarias fueron
significativamente más frecuentes entre los niños con formas más sintomáticas de la infección (DW
y SD) (P = 0,003, prueba exacta de Fisher) que en los niños con dengue, en quienes se encontró una
frecuencia comparable de infecciones primarias y secundarias. ( Tabla 1 ). El virus fue tipificable en
el 60% de los niños con infección por DENV, siendo DENV-1 y DENV-2 , cada uno de los cuales
constituía aproximadamente el 40% de los casos tipificables, siendo los serotipos detectados con
mayor frecuencia. DENV-3fue identificado en el 11% de los casos. De acuerdo con informes
regionales anteriores que muestran una baja frecuencia de circulación de DENV-4 ( Mercado, 2014),
este serotipo no se identificó en ninguno de los niños incluidos en este estudio (Tabla 1).
• La mediana del número de plaquetas en niños con SD fue 30 × 10 3 / μL, mientras que los valores fueron 163 y 121 para
dengue y DW, respectivamente (P = 0,0001, prueba de Kruskal-Wallis, prueba post hoc de Dunn) ( tabla 1 ). En los tres
grupos, la mediana del número de leucocitos fue comparable (P = 0,102, prueba de Kruskal-Wallis). Los niveles de aspartato
aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT) fueron significativamente más altos en los niños con SD que en
los niños con DW (P = 0,002 y P = 0,040, respectivamente, prueba de Mann-Whitney). La Tabla 1 proporciona información
que respalda la clasificación clínica adecuada de los niños con dengue incluidos en este estudio.
• Los niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38 en niños con enfermedad de dengue clasificada clínicamente como dengue, DW
o SD se determinaron mediante ELISA. Como se muestra en la Fig. 4 A, los niveles plasmáticos de sCD27 fueron de 2 a 10
veces más altos en los niños con SD que en los niños con dengue (P = 0,001, prueba post hoc). Además, los niños con DW y
SD tenían niveles de sCD27 más altos que los niños sanos (P = 0.01 y P <0.0001, respectivamente, prueba post hoc). Para el
sCD38, la comparación entre sanos, dengue, DW y SD no mostró diferencias significativas (P> 0.05, prueba de Kruskal-
Wallis, datos no mostrados), probablemente debido a la alta variabilidad en los niveles plasmáticos de este marcador ( Fig.4
B). Sin embargo, cuando solo se analizaron los niños infectados con DENV, los niños con SD tenían niveles
significativamente más bajos de sCD38 que los niños con dengue (P = 0,005, prueba de Mann-Whitney, Fig. 4 B). Luego
analizamos los niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38 en los niños infectados con DENV clasificados según las guías de la
OMS de 1997 ( Organización Mundial de la Salud - DSG apoyado por la Unión Europea, 1997 ), ya que esto ha demostrado
ser útil en estudios de fisiopatología . De manera similar a los resultados obtenidos con las directrices revisadas de la OMS
de 2009, se encontraron niveles más altos de sCD27 circulando en niños con dengue hemorrá[Link] III-IV que en los
niños con dengue (P = 0,03, prueba post hoc, datos no mostrados). Independientemente, no se encontraron diferencias en
sCD38 entre los grupos de dengue (P = 0.22, prueba de Kruskal-Wallis, datos no mostrados). Sin embargo, los niveles
plasmáticos detectables de sCD38 fueron más frecuentes en niños con dengue que en niños con dengue hemorrágico (P =
0,03, prueba exacta de Fisher, datos no mostrados), lo que respalda el posible papel de sCD38 en la enfermedad grave por
dengue.
Figura 4 . Se detectan niveles
significativamente más altos de sCD27 pero no
sCD38 en el dengue grave en comparación con
el dengue leve . Se utilizó plasma de niños
sanos y niños con enfermedad de dengue
clasificada clínicamente como dengue, dengue
con signos de advertencia (DW) y dengue
severo (SD) para la determinación ELISA de
los niveles plasmáticos de sCD27 (A) y sCD38
(B). La correlación entre los niveles de sCD27
(C) y sCD38 (D) y la gravedad de la
enfermedad en todos los niños infectados con
DENV incluidos se realizó utilizando el 
número de plaquetas como un marcador clásico
de la gravedad de la enfermedad. Se muestran
los valores de p de las pruebas de Kruskal-
Wallis, post hoc de Dunn (A y B) y de
correlación de Spearman (C y D).
• La relación entre ambos biomarcadores y la gravedad clínica en todos los pacientes infectados
por DENV se estableció mediante la evaluación de la trombocitopenia, un marcador
clásicamente asociado con la gravedad de la enfermedad, en las mismas muestras en las que se
cuantificaron sCD38 y sCD27 ( fig. 4 C y D). Aunque sin una correlación significativa, se
encontró una tendencia negativa para el plasma sCD27 (rho = −0,27, P = 0,06 prueba de
Spearman, Fig. 4 C). Por el contrario, se observó una correlación positiva y moderada entre los
niveles plasmáticos de sCD38 y el número de plaquetas en la fase aguda (rho = 0,49, P =
0,0004 prueba de correlación de Spearman, Fig. 4 D). El análisis adicional no reveló
correlación entre sCD27 y sCD38 con otros parámetros de enfermedad grave como el número
de leucocitos,enzimas hepáticas o índice de derrame pleural , aunque se encontró una
tendencia positiva entre el nivel plasmático de sCD27 y el hematocrito (rho = 0,26, P = 0,062,
prueba de Spearman) o hemoglobina (rho = 0,26, P = 0,080, prueba de Spearman) (datos no
mostrados ).
• Por tanto, el aumento de sCD27 en plasma durante la fase aguda de la infección por DENV se
asocia con una enfermedad grave, lo que sugiere un posible papel en la patogenia. Para la
sCD38, se observó un fenómeno opuesto, lo que sugiere un papel contrario (posiblemente
protector) de este marcador en la enfermedad del dengue.
• 4 . Discusión
• En este estudio, analizamos la liberación de sCD27 y sCD38 por células B estimuladas in vitro o activadas naturalmente por la infección por DENV en niños. Además, también se investigó el efecto de la infección sobre los niveles plasmáticos de estos marcadores y las
asociaciones con la gravedad clínica de la enfermedad del dengue en los niños.
• Como se informó anteriormente ( Amanna y Slifka, 2006 ), las células B vírgenes y las células mB se diferencian en plasmablastos después de la estimulación policlonal in vitro y coexpresan altos niveles de CD27 y CD38 de superficie ( Fig. 1 A). De acuerdo con la
aparición de plasmablastos, se encontró un aumento significativo en los niveles de sCD27 en los sobrenadantes de cultivo de células B estimuladas ( Fig. 1 B), lo que sugiere que durante la diferenciación, las células B humanas posiblemente plasmablastos liberan sCD27 in
vitro. Se han detectado niveles elevados de sCD27 en plasma en pacientes con ciertos tipos de linaje de células Bmalignidades, y estos altos niveles se correlacionan con una alta expresión superficial de este marcador en las células B tumorales ( Goto et al., 2012 ), lo que
respalda la idea de que este fenómeno puede ocurrir in vivo . Además, las células B humanas amigdalinas activadas in vitro con estímulos policlonales comparables a los utilizados en el presente estudio ( Bohnhorst et al., 2002 ) liberan cantidades significativas de este
marcador, lo que en conjunto confirma que no solo las células T sino también las células B activadas, posiblemente plasmablastos , puede ser una fuente de sCD27.
• Debido a que los altos niveles de activación de células T se han atribuido tradicionalmente a la infección por DENV ( Green et al., 1999 ), no es sorprendente que las células T circulantes de niños infectados de forma aguda con DENV expresen y liberen sCD27 ( Fig. 2 A y
B). Debido a que el CD27 es un marcador de linaje linfoide expresado en células T vírgenes y de memoria ( Watts, 2005 ), se encontró una frecuencia elevada de células T CD27 + circulantes en niños sanos y en niños con infección por DENV en fase de convalecencia ( 
Fig.2B). Sin embargo, como se encontró en este estudio DENV, el aumento de la expresión superficial de CD27 en las células T se ha utilizado como marcador de activación inmunitaria en otras enfermedades virales como el VIH-1, Epstein-Barr o la hepatitis C ( Appay
et al., 2002 , Slyker et al., 2011 ). Curiosamente, la infección con DENV indujo la liberación espontánea de sCD27 por las células B purificadas, y esta liberación se correlacionó con la frecuencia de plasmablastos pero no con otras subpoblaciones importantes de células B
en los cultivos ( Fig. 2 C). La relación entre la frecuencia de plasmablastos circulantes y los niveles plasmáticos de sCD27 (medidos el mismo día) in vivono fue significativa (rho = 0.55, P = 0.10, prueba de Spearman, datos no mostrados), posiblemente porque las células T
también están involucradas en la respuesta sistémica, como se observa en la Fig.2 A. En particular, la infección secundaria con DENV induce una aumento de plasmablastos, que circulan durante la fase aguda, convirtiendo temporalmente estas células en una 
subpoblación de células B relevante ( Wrammert et al., 2012 , Zompi et al., 2012 ). Proponemos que las células B circulantes, posiblemente plasmablastos inducidos por la infección por DENV, pueden liberar sCD27. La forma soluble de CD27 es funcional cuando se une a
su receptor ( Hintzen et al., 1991 ). Por ejemplo, la adición de sCD27 recombinante a PBMCaumenta la proliferación de células T, y niveles altos de este marcador in vivo se han asociado con protección contra tumores en humanos ( Huang et al., 2013 ). A diferencia de
sCD27, sCD38 se detectó en el plasma pero no en el sobrenadante del cultivo de células aisladas de niños infectados con DENV (datos no mostrados). La falta de enzimas necesarias para la escisión y liberación de sCD38 en el sistema in vitro podría explicar estos
hallazgos. A diferencia del CD27, cuya expresión está particularmente restringida a células de linaje linfoide, el antígeno CD38 tiene un patrón de expresión amplio que incluye células no hematopoyéticas y se ha informado una expresión marcada de CD38 en hígado, 
músculo cardíaco, tejidos renales y neuronales ( Malavasi et al., 2008 ). Es de destacar que estos órganos se han visto afectados durante la infección por DENV ( Povoa et al., 2014 ). Por lo tanto, también es posible un origen de tejido periférico de sCD38 circulante.
• sCD27 juega un papel homeostático crítico en condiciones de estado estacionario, y niveles plasmáticos significativos de este marcador circulan en voluntarios sanos, como se encuentra en este estudio ( Fig. 3 A) ( Bohnhorst et al., 2002 ). De hecho, los pacientes con
mutaciones de CD27 que conducen a reducciones drásticas en la expresión y en el nivel plasmático soluble pueden sufrir infecciones graves por el virus de Epstein-Barr y una deficiencia primaria en anticuerpos específicos ( Alkhairy et al., 2015 ).
• Se encontró un aumento selectivo significativo en los niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38 en niños con dengue durante la fase aguda ( Fig. 3 A y B). La liberación de sCD27 y sCD38 observada en otras enfermedades ocurre después de la activación de linfocitos y puede
explicarse por dos mecanismos principales: (i) empalme diferencial del receptor y (ii) escisión por metaloproteinasas de matriz (MMP) ( Malavasi et al., 2008 , Kato et al., 2007 ). La administración de GI5402, un inhibidor de MMP-1 , -3, -9 y -13, reduce los niveles
plasmáticos de sCD27 después de la endotoxemia experimental con LPS en individuos sanos ( Dekkers et al., 2000). En el caso de sCD38, el tratamiento con AP-p-tosil- L -lisina clorometil cetona , un inhibidor de MMP en CD38 humanos + líneas celulares, parcialmente
escisión inhibida de CD38, lo que sugiere que estas proteasas juegan un papel crítico en la liberación de CD38 ( Funaro et al., 1996 ). Curiosamente, se ha descrito un aumento de los niveles plasmáticos de MMP-2 y -9 en la enfermedad del dengue y se ha asociado con la
gravedad clínica ( Kubelka et al., 2010 ). Además de la activación inmune, el aumento de los niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38 observa en los niños infectados con DENV ( Fig. 3) podría deberse a una mayor actividad de MMP durante la infección por DENV. Los
niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38 fueron significativamente más altos durante la fase crítica de la enfermedad ( Fig. 3 C y D), período en el que se presentan las complicaciones ( Organización Mundial de la Salud - DSG con apoyo de la Unión Europea, 2009 ). La
activación inmunitaria, en particular la activación de las células T, es más fuerte durante las infecciones secundarias ( Hatch et al., 2011 , Weiskopf et al., 2013 ). Además de las células T, se ha demostrado que la magnitud de la respuesta del plasmablast circulante aumenta
durante las infecciones secundarias y se ha asociado con la gravedad de la enfermedad ( García-Bates et al., 2013). En consecuencia, en este estudio, encontramos que los niveles plasmáticos de sCD27 eran significativamente más altos durante las infecciones secundarias ( 
Fig. 3 E). La presencia del virus o sus componentes en la circulación no fue necesaria para el aumento de los niveles plasmáticos de sCD27 y sCD38 ( Fig. 3 C y F) observado durante la fase aguda. La inducción y activación inmunitarias y el potencial de complicaciones
clínicas ocurren después de la fase febril de la enfermedad (días 4-6), un momento en el que, en la mayoría de los casos, el virus o sus componentes ya no están circulando. Esto indica que la liberación de sCD27 es un proceso mediado por la inducción de la respuesta
inmune.
• Como las formas solubles de CD27 y CD38 son funcionales cuando se unen a sus receptores celulares específicos ( Borst et al., 2005 , Malavasi et al., 2008 ), la liberación plasmática de estos dos marcadores podría tener implicaciones fisiopatológicas para la enfermedad
del dengue. La sCD27 se ha implicado en la diferenciación de células mB a células secretoras de anticuerpos y en el aumento de la secreción de IgG total a través de la interacción con CD70 , modulando así los factores de transcripción asociados con la diferenciación
terminal de las células B, como XBP1 y Blimp-1 ( Dang et al., 2012 ). Se ha descrito una correlación entre sCD27 e IgG plasmática no específica de antígeno en humanos ( Bohnhorst et al., 2002), lo que apoya su posible relación in vivo . Además, en los mastocitos
humanos, sCD27 induce la expresión de CD40L y APRIL ( Ho et al., 2008 ), dos moléculas implicadas en la activación y el cambio de isotipo de las células B. Por lo tanto, la vía CD27-CD70 podría ser crítica para la patogénesis del dengue. El CD38 actúa como un
correceptor en las células B, con la capacidad de modular las señales transmitidas a través del receptor de las células B ( Lund et al., 1996 ), y el sCD38 aumenta la supervivencia y prolonga el tiempo durante el cual se pueden detectar las células mB específicas de antígeno. 
en un ensayo de dilución limitante funcional ( Liu et al., 2008). Por lo tanto, los niveles plasmáticos elevados de sCD27 y sCD38, que se sabe que modulan la respuesta de las células B, también pueden estar involucrados en la modulación de esta respuesta durante la
infección por DENV.
• A diferencia de lo que se encontró para la sCD27, los niños con dengue tenían niveles significativamente más altos de sCD38 que los niños con SD ( Fig. 4 B), lo que sugiere un papel posiblemente protector en las formas clínicamente más relevantes de la enfermedad. Se
desconoce el mecanismo involucrado en esta protección. Sin embargo, la sCD38 plasmática elevada podría bloquear la unión entre la membrana CD38 y CD31 en las células endoteliales (actuando como receptor señuelo), previniendo la adhesión y activación de células
inflamatorias ( Eugenin et al., 2006 , Fornasa et al., 2010 ). La infección in vitro con DENV disminuye la expresión de CD31 en las células endoteliales y se ha relacionado con la fuga vascular ( Kanlaya et al., 2009 ,Luplertlop et al., 2006 ). Debido a que la unión de CD31-
CD38 es necesaria para la escisión enzimática y la liberación de sCD38, los cambios en la expresión de CD31 podrían modular la liberación de sCD38 in vivo .
• La sCD27, pero no la sCD38, puede ser liberada por células B activadas posiblemente, plasmablastos inducidos por activación policlonal in vitro o por infección natural con DENV, lo que podría indicar otro papel de estas células en la patogénesis de la enfermedad. La
 infección por el virus del dengue en los niños aumentó significativamente los niveles plasmáticos de estos dos marcadores, que también se relacionaron con la gravedad de la infección. Proponemos sCD27 y sCD38 como dos nuevos biomarcadores útiles y fácilmente
medibles que reflejan el grado de activación inmune en la enfermedad del dengue.
B cells naturally induced during dengue virus infection reléa
Cd27, the plasma level of which is associated with severe fo
 B-CELL ISOLATION
ANTI- CD43

Albertoni G et al. Brasil J Infec Dis 2011; 547 - 552