CHRISTIAN GRAM
Un médico danés, llamado Christian Gram,
descubrió en 1883 un método especial de
tinción que es de gran valor practico en
bacteriología, ya que para el año de 1886 pudo
ser utilizado para dividir a las bacterias en dos
grandes grupos
TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram es una tinción diferencial muy utilizada
en Bacteriología para observar bacterias en muestras
clínicas. Debe su nombre a Christian Gram (1984)
FUNDAMENTO
El fundamento de la tinción de Gram se basa en las
diferencias de la pared celular de las bacterias
Grampositivas y Gramnegativas
FUNDAMENTO LA PARED CELULAR DE LAS
BACTERIAS GRAM POSITIVAS
posee una gruesa capa de peptidoglicano (retiene el
complejo colorante-mordiente)y dos clases de ácido
teicoico
FUNDAMENTO DE LA PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS GRAM
POSITIVAS
La pared celular de las bacterias Gram negativas tiene
una capa de peptidoglucano más fina (facilita la salida
del complejo colorante-mordiente)
¿En qué consiste la Tinción de Gram?
La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio
diseñada por Christian Gramen el año 1884. El objetivo
de Gram era conseguir una prueba con la que fuera
posible diferenciar diferentes grupos de bacterias para así
poder estudiarlas y clasificarlas.
Factores que alteran la tinción de Gram
•Edad de la bacteria.
•Errores del operador.
•Uso de antibióticos
Material necesario:
•Placa Petri con agar chocolate
•Asa de siembra o material estéril para sembrar
•Mechero de alcohol
•Agua destilada
•Colorantes de tinción Gram (cristal violeta,
lugol, alcohol-acetona 1:1, safranina)
•Cristalizador y varillas de tinción
•Portaobjetos
•Alcohol 96º
•Papel secante
•Microscopio óptico
Procedimiento Tinción de Gram
En primer lugar, para realizar una tinción, lo que tenemos que
tener son microorganismos sembrados. Dichos
microorganismos los hemos el día anterior mediante la técnica
de siembra de estría múltiple, los hemos dejado incubar durante
24 horas a 37ºC en la incubadora para así obtener las colonias
de los diferentes microorganismos. En este caso son
microorganismos de la orofaringe.
Siempre que “destapemos” una placa con colonias, deberá
hacerse en condiciones de esterilidad. Para conseguir estas
condiciones podemos utilizar un mechero Bunsen o un mechero
de alcohol. Con el mechero, conseguiremos que se forme un
ambiente de esterilidad alrededor de la llama, por lo tanto, si
trabajamos cerca del mechero, tendremos un ambiente estéril.
A la hora de comenzar con la tinción, lo primero que hay que
realizar es un frotis del microorganismo, para ello hay que
añadir una gota pequeña de agua destilada (cuanto mayor sea la
gota, tardará más tiempo en secarse).
Debemos coger la muestra con el asa bacteriológica
previamente esterilizada. Para ello encendemos el mechero de
alcohol y ponemos el asa en posición vertical encima del
mechero hasta que el hilo del extremo del asa se quede
totalmente incandescente.
Después debemos esperar a que se enfríe porque si tocamos con
el hilo incandescente las colonias podemos matar al
microorganismo.
Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el
agar para comprobar que éste está frío.
A continuación, cogemos unas colonias de las bacterias y las
extendemos sobre la gota de agua destilada.
Una vez extendido, volvemos a esterilizar el asa, ya que todo
material debe ser esterilizado antes de volver a ser guardado. A
continuación, lo que tenemos que hacer es fijar la muestra, la
cual se puede fijar con metanol o se puede fijar con calor. En
este caso utilizaremos la fijación por calor.
Tenemos que hacer movimientos circulares o en zig zag por
encima de la llama del mechero, levantando constantemente la
muestra para que no se nos queme el tiempo suficiente para que
la muestra quede totalmente seca y por lo tanto fijada.
Una vez fijada la muestra apagamos el mechero por seguridad.
Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de microorganismos en el
portaobjeto con diferentes tipos de tinciones para poder
visualizar cada microorganismo (bacteria) al microscopio.
Las tinciones se realizan en un cristalizador, también utilizamos
varillas de tinciones y el porta con la muestra.
Vamos a utilizar diferentes reactivos para la tinción. En primer
lugar el cristal violeta, en segundo lugar el lugol,
usaremos también alcohol de 96º (el decolorante puede estar
formado por una mezcla de alcohol, alcohol-acetona y por
diferentes mezclas),
y por último la safranina.
¿Qué va a ocurrir?
Las bacterias gram positivas y las bacterias gram negativas tienen diferente grosor en el peptidoglicano de su pared celular, de tal
forma que cuando echemos el cristal violeta se nos van a teñir tanto las gram positivas como las gram negativas. El lugol lo que
hará, será fijar el colorante del cristal violeta a las bacterias, con el alcohol (o mezcla decolorante), lo que haremos será eliminar el
cristal violeta de las gram negativas y por último, la safranina, va a teñir solamente a las gram negativas que son las que están
decoloradas. Por lo tanto, las gram positivas estarán teñidas de cristal violeta y las gram negativas de safranina (color fucsia).
El protocolo será aplicar a las bacterias fijadas cristal
violeta durante un minuto, luego lavar con el frasco lavador. A
continuación, añadir lugol durante un minuto, volver a lavar con
el frasco lavador. Después, añadir durante 10 o 15 segundos la
mezcla de alcohol o alcohol-acetona…, lavar la muestra con el
frasco lavador. Y finalmente, añadir safranina durante un
minuto y lavar con agua destilada.
Por lo tanto, tal y como hemos dicho, aplicamos el cristal
violeta.
Una vez que ha transcurrido el minuto lo lavamos Ahora vamos a añadir el lugol justo por encima de la
con agua destilada. zona de la muestra y esperamos otro minuto.
Ya ha transcurrido el minuto y lavamos con agua destilada. A
continuación decoloraremos la muestra con el alcohol. Para
conseguirlo hay que incorporar el porta de un lado para ir
añadiendo el alcohol y que vaya resbalando para abajo. Cada
protocolo estipula un tiempo pero con 15 segundos
aproximadamente la muestra quedará decolorada.
Tras los 15 segundos de decoloración, aclararemos con
agua destilada para que el alcohol no siga actuación,
porque si no paramos el proceso de decoloración a
tiempo, todas las bacteria quedarían decoloradas, no
solamente las gram negativas y por lo tanto no podríamos
diferenciar unas de otras.
Por último, aplicamos a la muestra la safranina y lo dejamos
actuar durante otro minuto.
Transcurrido el minuto, volvemos a aclarar la muestra con agua
destilada y dejaríamos que la muestra se secara.
Posteriormente observaremos la muestra con el microscopio.
