Espectrometría de

Luminiscencia Molecular
FLUORESCENCIA Y
FOSFORESCENCIA
 Fluorescencia

Espectrometría de Fosforescencia
Luminiscencia
Molecular Quimioluminiscencia

Las moléculas del analito se excitan para dar

una especie cuyo espectro de emisión
suministra información para análisis cualitativo
y cuantitativo
FLUORESCENCIA El Fluoróforo absorbe
luz de una determinada
longitud de onda y se
Diagrama de jabloski excita a estados
energéticos
superiores

S1 KISC
Kr
Knr { T1
he
ha KT

S0
Mecanismos de disipación
de la energía

10-12 s

10-9 s
FLUORESCENCIA Los electrones vuelven
al estado basal
emitiendo luz de
Diagrama de jabloski una longitud de onda
mayor
(ie de menor energía)

S1 KISC
Kr
Knr { T1
he
ha KT

S0
FLUORESCENCIA Quenching, retorno de
los electrones al nivel
basal sin emitir luz
Diagrama de jabloski

S1 KISC
Kr
Knr { T1

he Puede suceder por:

ha KT •Reacciones en el estado
excitado
•Rearreglos moleculares
S0 •Transferencia de energia
•Colisiones con un
quencher
Mecanismos de disipación
de la energía
Los espectros de absorción y
emisión:
Los fluoróforos tienen un
espectro de absorción y emisión
bien definidos.
Existe una diferencia entre los
picos de absorción y emisión de
un fluoróforo (Stokes Shift)
La intensidad de fluorescencia
emitida varía con la longitud de
excitación, pero no varía la
distribución del espectro
 Photobleaching (fading):
 Es la destrucción, usualmente irreversible,
delfluoróforo en el estado excitado. Se
pueden producir modificaciones químicas (de
uniones covalentes, por ejemplo).
 Para evitar este proceso se usan condiciones
de baja iluminación,
 Ocurre en condiciones de alta intensidad de
iluminación, y de altos niveles de O2.
detectores altamente sensibles, objetivos y
filtros ópticos optimizados.
 Comercialmente se han desarrollado
productos con menor labilidad ante la
estimulación lumínica (por ejemplo los
fluoróforos Alexa).
 También se desarrollaron sustancias
“antifade” que reducen el bleaching
(Slow Fade, Vecta Shield, etc).
Sin embargo estas sustancias no se
pueden utilizar en células vivas.
 Estados exitados que producen
Fluorescencia y Fosforescencia
Pauli, establece que en un
 Espin del electron:
átomo no puede haber dos
electrones con los cuatro
números cuánticos iguales.
No debe haber mas de dos
electrones en un orbital y los dos
deben tener los estados de espin
opuestos
Existen moléculas DIAMAGNETICAS
Y PARAMAGNETICAS.
Estado electrónico molecular

Estado Estado Estado

Singulete Singulete Triplete
Fundamental Excitado excitado

La nomenclatura de singulete, doblete y triplete

deriva de consideraciones de MULTIPLICIDAD
espectroscópica
Estados exitados que producen
Fluorescencia y Fosforescencia

Estado Singulete Excitado

10-8, a 10-5 s
Estado Singulete Excitado
10-8, a 10-5 s
ENERGIA

Estado triplete Excitado

10-4 s ó mas

Estado Singulete Fundamental

Velocidades de absorción
y emisión
La velocidad con que se absorbe un fotón
es enorme.
La emisión fluorescente se realiza a una
velocidad significativamente mas lenta
El tiempo de vida del estado excitado se
relaciona inversamente con la absortividad
molar del pico de absorción
correspondiente a la excitación.
Rendimiento cuantico
00
n de
defotones
fotonesemitidos
emitidos IIee
n
  00  
nn de
defotones
fotonesabsorbidos
absorbidos IIaa

KKf f
 
KKf f  KKcesces  KKcece  KKcici  KKpdpd  KKdd
fluorescencia conversión cruce conversión predisociación
externa entre interna disociación
sistemas
Normalmente, el tiempo de vida media de una
especie excitada es breve porque hay diversas
formas en las cuales un átomo o una molécula
excitada liberan su exceso de energía y se relajan a
su estado fundamental.

Dos de las más importantes de estos mecanismos son

la relajación (desactivación) no radiante y la
relajación fluorescente.

Relajación vibracional

Relajación no radiante
Conversión interna
La relajación vibracional , señalada por las
flechas onduladas cortas entre los niveles de
energía vibracionales, tiene lugar durante las
colisiones entre moléculas excitadas y las
moléculas del disolvente. • Durante estas
colisiones el exceso
de energía vibracional
se transfiere a las
moléculas del
disolvente en una
serie de etapas como
se indica en la figura.
• La ganancia de
energía vibracional
del disolvente se
refleja en un ligero
incremento de la
temperatura del
medio.
10-15 s aproximadamente.
También puede ocurrir el relajamiento no radiante entre
el nivel vibracional inferior de un estado electrónico
excitado y el nivel vibracional superior de otro estado
electrónico.
Este tipo de relajación llamado algunas veces
conversión interna, se ilustra por las flechas onduladas
largas.

Conversión interna:
una transición entre
estados de la misma
multiplicidad entre
estados de la misma
multiplicidad
La fluorescencia. Se puede observar que las
bandas de radiación son producidas cuando las
moléculas fluorecen debido a que las moléculas
electrónicamente excitadas se pueden relajar a
cualquiera estados vibracionales del estado
electrónico fundamental.
Las bandas de
fluorescencia
molecular están
formadas por una
multitud de líneas
espaciadas tan
estrechamente que
son muy difíciles de
resolver
las constantes de velocidad relativa kx. para los
procesos por en el que se desactiva el estado
singlete

Estos procesos son:

fluorescencia (kf)
conversión externa (kces)
cruzamiento entre sistemas (kce)
conversión interna (kci)
predisociación (kpd)
disociación (kd)
Este desplazamiento hacia longitudes de onda
mayores se llama desplazamiento de Stokes.

En aquellos casos en los que la radiación absorbida

sea emitida sin cambio en la longitud de onda
(misma energía) se conoce como radiación de
resonancia o resonancia fluorescente.
Ejemplo de absorción y
emision de un compuesto
Estructura de algunos
fluoroforos
La fluorescencia y la
estructura
 La fluorescencia más intensa y la mas
útil es la que presentan los compuestos
que contienen grupos funcionales
aromáticos con transiciones * de
baja energía.
Efectos de temperatura y
disolvente
A mayor temperatura menor fluorescencia debido a que
al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la
temperatura es elevada aumenta la probabilidad de
desactivacion por conversión externa.

La fluorescencia de una molécula se reduce en

presencia de solventes que poseen atomos pesados
como el tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo. Lo
mismo ocurre cuando a moléculas fluorescentes se les
adiciona un átomo pesado.
c
 donde P0 es la potencia del haz incidente
sobre la disolución y P es su potencia
F = K' (P0 - P) después de atravesar la longitud b del
medio.
La constante K' depende de la eficacia
cuántica del proceso de fluorescencia.
Con objeto de relacionar F con la
concentración c escribimos la ley de Beer
así:

sustituyendo nos queda: F = K' P0 (1 - 10- bc)

Si desarrollamos el término exponencial como una serie de
Maclaurin será;
Siempre que 2.303ebc < 0.05 podemos
escribir que,

F = K'P0 2.303bc

y si P0 se mantiene constante,

F = Kc
VARIABLES QUE AFECTAN A LA
FLUORESCENCIA

1.- Rendimiento cuántico: El rendimiento

cuántico o la eficacia cuántica de la
fluorescencia es simplemente las relación entre
el número de moléculas que emiten
fluorescencia respecto al número total de
moléculas excitadas. Las moléculas altamente
fluorescentes, por ejemplo, la fluoresceina,
tienen eficiencias cuánticas que, en ciertas
condiciones, se aproximan a la unidad. Las
especies no fluorescentes tienen eficiencias que
son prácticamente cero.
2.- Estructura: La fluorescencia más intensa y la
más útil es la que presentan los compuestos que
contienen grupos funcionales aromáticos.

Los compuestos que contienen estructuras

alifáticas y alicíclicas de carbonilo o estructuras
con dobles enlaces muy conjugados pueden
presentar también fluorescencia.
La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no
sustituidos son fluorescentes en disolución, la
eficacia cuántica aumenta con el número de anillos
y con su grado de conjugación.

La sustitución en un anillo aromático causa

desplazamientos en la longitud de onda de
absorción máxima y los cambios correspondientes
en los picos de fluorescencia.
3.- Rigidez estructural: Empíricamente se
encuentra que la fluorescencia está particularmente
favorecida en moléculas que poseen estructuras
rígidas.

las eficacias cuánticas para el fluoreno y el bifenilo están próximas a 1.0 y

0.2, respectivamente, bajo condiciones similares de medida.

La influencia de la rigidez también tiene

importancia en el aumento de la fluorescencia de
ciertos quelatantes orgánicos cuando están
formando un complejo con un ion metálico.
4.- Temperatura y disolvente: La eficacia cuántica
de la fluorescencia disminuye en muchas moléculas
con el aumento de la temperatura, ya que el
aumento de la frecuencia de las colisiones a
temperatura elevada hace aumentar la probabilidad
de desactivación no radiante ( conversión externa ).

Una disminución en la viscosidad del disolvente

también aumenta la probabilidad de conversión
externa y produce el mismo resultado.
5.- Efecto del pH: La fluorescencia de un
compuesto aromático con sustituyentes ácidos o
básicos en el anillo depende normalmente del
pH.

Tanto la longitud de onda como la intensidad de

emisión son probablemente diferentes para la
forma ionizada y no ionizada del compuesto.

Por lo tanto será muy frecuente en los métodos

fluorimétricos el control estricto del pH.
Espectrofluorimetros
 ESPECTROFLUORIMETRO
Monocromador

Fuente
90o

Monocromador

Detector
Dinodos =
fotoelectromultiplicador
electrones
Sales liberar fácilmente
electrones

Plastico polimero

+
e e
e
e
diodo

n
p
exitacion

200 400

emision

500
800
Mantener constante la
longitud de onda de
excitación, y se escanea en un
rango de longitudes de onda
de emisión, luego cambie la
onda de excitación
incrementando la longitud de
onda y se repite el escaneo
• En un espectrofotómetro de haz único, las
fluctuaciones en la fuente se corrigen en cada
longitud de onda (y con el tiempo) pero midiendo
un blanco (para establecer el 100% de
trasmitancia) y bloqueando la trayectoria de la luz
para establecer el 0% de transmitancia.
• Esto ayuda a tener en cuenta las fluctuaciones de
intensidad de la fuente.
• Sin embargo, dado que las fluctuaciones de la
intensidad de la fuente pueden tener un mayor
impacto en los espectros de fluorescencia, las
correcciones en tiempo real de esta área se
realizan utilizando un transductor de referencia
único
Un transductor es un
dispositivo capaz de
transformar o convertir
una determinada
manifestación de 
energía de entrada, en
otra diferente de
salida, pero de valores
muy pequeños en
términos relativos con
respecto a un
generador.
 Y FLUORIMETRO
Filtros

Fuente

Filtros

Detector
Optical Fluorescent Sensor Technology
QUIMIOLUMINISCENA
Y BIOLUMINISCENCIA
PROCESOS
LUMINISCENTES

Conjunto de técnicas caracterizadas

por la producción de especies en
estado excitado cuyo espectro de
emisión, al regresar al estado
fundamental, suministra
información para el análisis
cualitativo y cuantitativo  
Generación del estado
electrónicamente excitado
 Ruptura de enlaces, intra- o
intermolecular.
 Formación de enlaces
intramolecular o mediante colisión
e interacción de radicales, iones,
átomos o moléculas. 
 Transferencia de energía
La Quimioluminiscencia

 es el fenómeno de emisión de
radiación electromagnética,
ultravioleta o visible, que se observa
cuando una especie
electrónicamente excitada,
producida por una reacción química
a temperatura ambiente regresa a su
estado fundamental.
 Cuando la reacción
quimioluminogénica es
enzimática, ocurre en un
organismo vivo o bien se produce
en sistemas químicos derivados
de éstos, al fenómeno se le
denomina BIOLUMINISCENCIA
Bioluminiscencia
Evolución histórica de los
fenómenos quimio / luminiscentes
CIENTÍFICOS ACONTECIMIENTOS
Aristóteles ( s. IV a.C.) Obra "De Anima"
Boyle (1627-91) Importancia del O2
Radziszewki (1877) Primer compuesto QL sintético
Wiedemar (1880) Quimioluminiscencia
Dubois (1885) Experimento con luciferasa
Trauzt (1905) Clasificación sistemática
Bancrort (1914) electroquimioluminiscencia
Kautsky (1922) Uso de siloxenos
Dufford (1923) Quimioluminiscencia y fluorescencia
Mallet (1927) Reacción con H2O2 + ClO4-
Albrecht (1928) Reacción con luminol
Gleu y Petsch (1935) Reacción con lucigenina
Primer estudio sobre la aplicación analítica
Erdey (1957)
de la QL
Rauhut (1965) Reacción con peroxioxalatos
FUNDAMENTOS
TEÓRICOS
 Requisitos para la emisión
quimioluminiscente

 a) Reacción química exotérmica 

 b) Camino de reacción favorable ( E*< E )
 c) Emisión de un fotón como proceso de
desactivación más favorable
Factores que afectan a la
emisión

 1) Estructura química del sustrato

quimioluminogénico
 2) Naturaleza y concentración de
otros sustratos.
 3) Naturaleza del catalizador
 4) Iones metálicos
 5) pH
 6) Temperatura
 7) Hidrofobicidad del
disolvente.
 8) Presencia de aceptores de
transferencia de energía
METODOLOGÍA ANALÍTICA E
INSTRUMENTACIÓN
 Características analíticas de la
Quimioluminiscencia  
 1. Elevada sensibilidad
 2. Ausencia de fuente de radiación externa
 - Inexistencia de dispersión o señal de fondo
 - Ausencia de problemas derivados de la
inestabilidad de la fuente
 - Reducción de interferencias
 3. Selectividad y linealidad dependientes
de la reacción
 4. Posibilidad de determinar distintas
especies químicas
 - La especie precursora o quimioluminogénica
 - Reactivos (oxidantes, etc) y fluoróforos
 - Activadores o inhibidores.
 Cofactores, reactivos intermedios, etc.
El material genético de uno
de los organismos
mencionados encuentra un
camino en el ADN de
rudolph, el reno también
podría brillar o al menos
podría hacerlo su nariz.

La madre de rudolph,
mientras estaba
embarazada, se hubiera
cruzado con el coral
anthozoan, una especie de
color rojo brillante que se
encuentra en aguas
tropicales poco profundas, y
se hubiera cortado con este,
el ADN del coral podría
haber ingresado en su
torrente sanguíneo.
 luciferina

La luciferina (L) se modifica mediante utilización de oxígeno por las luciferasas, ahí se
forma un intermediario I y por último en un sustrato activo eléctricamente P*. Después
de un corto tiempo de vida se emiten fotones y el sustrato base P se alcanza

• el oxígeno oxida el sustrato 

•  la luciferasa acelera la reacción,
• y el ATP proporciona la energía para la
reacción, produciéndose agua y luz
El reno ártico (cuyo nombre
científico es  Rangifer
tarandus tarandus), la especie a
la que pertenece Rodolfo, puede
ver la luz ultravioleta, que es
invisible para los humanos y la
mayoría de los mamíferos.

Esta singular capacidad resulta

especialmente útil en pleno
invierno, cuando el sol está bajo
en el horizonte ártico y la luz tiene
es principalmente azulada y está
en el rango del ultravioleta.
Además, el tejido reflectante de los ojos del reno,
llamado tapetum lucidum,  cambia de color dorado
durante los meses de verano a un azul profundo
durante los meses de invierno.

 Este tejido, que provoca el brillo de los ojos en la

noche, ayuda a los animales nocturnos a ver en la
oscuridad, y con una coloración azul mejora su
capacidad de ver la luz azul que dispersa la atmósfera
en esa época del año.
• Pruebas para marcar proteínas (ANS)
• Pruebas de membrana (DHP)
• Pruebas de potencial de membrana
(Carbocianina)
• Pruebas de tinción cercanas al infrarrojo
(Cianina) Pruebas de DNA (Bromuro de
etidio)
• Pruebas de medición química (Fura -2 >
Ca2+) Pruebas Especiales (7-UmP >
ELISA)
 Instrumentación básica
Celda de
reacción
Detector

234

Amplificador

Cámara de
Registro
protección

4H + 2SO ---------S* + 4H O
2 2 2 2

S* S + h
2---------------------------- 2
Sistemas de detección

 Requerimientos
 Altamente sensible
 Amplio rango de sensibilidad y linealidad
 Amplia respuesta espectral
 Cuantitatividad
 Rápida respuesta
 Preciso y reproducible
 Estable, robusto y económico.
 Tipos
 1. Fotodetectores
 2. Contadores de centelleo líquido
 3. Sistemas de detección
fotográficos
 4. Sistemas de detección de
imágenes.
SISTEMAS
BIOLUMINISCENTES
 Detección quimioluminiscente en HPLC
 Requerimientos
 Adecuada configuración instrumental
Condiciones compatibles de
separación y detección
 Óptimo control de la intensidad de
emisión QL
 Aplicaciones
 1. Peroxioxalatos
 - Mediante formación de derivados:
aminoácidos, aminas, esteroides,..
 - Analitos fluorescentes
 2. Luminol
 - Metales de transición
 - Ligandos (catecolaminas, aminoácidos y
proteínas)
 - Especies derivatizadas precolumna con
luminol y derivados.
¿Cómo funcionan las
barritas luminosas?

La reacción entre los distintos compuestos de la
barrita luminosa provoca un liberación sustancial
de energía. Los átomos de estos materiales se
excitan, provocando que los electrones
asciendan a un nivel superior de energía, para
regresar después a sus niveles normales. Cuando
los electrones retornan a sus niveles normales,
liberan energía en forma de luz. A este proceso
se le llama quimioluminiscencia.
Empleados para medir la fosforescencia
son los fosforímetros. 

Los fosforímetros se diferencian de los

fluorómetros en que controlan la
intensidad luminiscente mientras la
radiación excitante no incide en la célula.
Los instrumentos utilizados para estudiar la fosforescencia son
similares en diseño a los fluorómetros y espectrofluorómetros que
acabamos de considerar, excepto que se requieren dos componentes
adicionales.

El primero es un dispositivo que irradia alternativamente la muestra y, tras

un tiempo de retardo adecuado, mide la intensidad de la fosforescencia.

Se requiere el retardo de tiempo para diferenciar entre la emisión de

fosforescencia de larga duración y la emisión de fluorescencia de corta
duración, las cuales se originarían en la misma muestra.

Se utilizan dispositivos mecánicos y electrónicos, y muchos instrumentos

de fluorescencia comerciales tienen accesorios para
mediciones de fosforescencia.

Muchos de los instrumentos actuales utilizan un esquema cerrado para el

retraso.

A menudo se utiliza una lámpara de arco de xenón pulsado para excitar la

muestra.
Después de un tiempo de retardo, especificado por el usuario, el sistema de
adquisición de datos se activa para obtener la señal de fosforescencia.

A menudo, la señal se integra durante este período cuando la lámpara está

apagada y la fluorescencia se ha reducido a un valor muy pequeño.

Se necesita un segundo componente nuevo porque las mediciones de

fosforescencia se realizan normalmente a la temperatura del nitrógeno
líquido en un medio rígido para minimizar la desactivación por colisión del
estado triplete de larga duración.

Por lo general, un matraz Dewar con ventanas de cuarzo, es parte de un

fosforímetro. A la temperatura utilizada, el analito existe como un soluto en
un vidrio o un solvente sólido. Un solvente común para este propósito es
una mezcla de éter dietílico, pentano y etanol.
 Una barrita típica de las que se venden en las
tiendas, consta de una carcasa de plástico
conteniendo fenil oxalato ester y una solución que
incorpore un tinte fluorescente. Además, dentro de
la carcasa de plástico existe un pequeño vial de
cristal (que se rompe cuando la carcasa de plástico
sufre una torsión) conteniendo una solución de
peróxido de hidrógeno, a la que se llama “activador”.
Así funciona la secuencia de sucesos que se dan
cuando ambas soluciones se combinan.
 El peróxido de hidrógeno oxida el fenil oxalato ester, lo cual
da como resultado un compuesto químico llamado fenol y
un ester peroxiácido inestable.
2) El ester peroxiácido inestable se descompone, dando
como resultado más fenol y un compuesto peróxido cíclico.

3) El compuesto peróxido cíclico se descompone en

dióxido de carbono.
4) Esta descomposición libera energía para el tinte.
5) Los electrones de los átomos del tinte saltan a un nivel
más alto, y luego vuelven a caer, liberando energía en
forma de luz.

Según el tinte que se emplee, la luz será de un color u
otro. Dependiendo de la clase de compuestos
utilizados, la reacción química durará unos pocos
minutos o varias horas. Si calientas las soluciones, la
energía extra acelerará la reacción y la barrita luminosa
brillará con más fuerza, pero durante menos tiempo. Si
enfrías las barritas, la reacción se ralentizará, y la luz se
hará más tenue. Si quieres que tu barra siga iluminando
al día siguiente, métela en el frigorífico. Esto no
detendrá el proceso, pero alargará la reacción
considerablemente.
 Explicación

El agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H2O2) es un

potente oxidante al contener un exceso de oxígeno. Al
mezclarlo con el bicarbonato sódico (NaHCO3), se produce una
reacción liberándose una gran cantidad de dióxido de carbono
(CO2) y energía que excita las moléculas de colorante del
refresco gaseoso. Cuando las moléculas excitadas vuelven a
su estado fundamental de mínima energía, se liberan fotones,
que constituyen la luz. Es por ello que el color (frecuencia) de la
luz emitida dependerá del tipo de colorante de la bebida.
 Material Necesario

• Botella de medio litro de refresco gaseoso de limón. Es conveniente que la botella sea de coljavascript:void(0)or verde por el color
de la luminiscencia.

• Botella de agua oxigenada (peróxido de hidrógeno), de las que se venden en las farmacias.

• Bote de bicarbonato sódico, utilizado en repostería o para la acidez de estómago.

Instrucciones

• Retira 3/4 de la bebida gaseosa dejando en su interior 1/4 de su contenido.

• Introduce en la botella una pizca de bicarbonato sódico, como la punta de una cuchara sopera.

• Vierte en la botella el contenido de agua oxigenada equivalente a tres tapones de la botella.

• Cierra bien la botella y agita la mezcla enérgicamente.

• Apaga la luz y maravíllate del resultado.