DETECTORES DE MASAS (HPLC Y
GC)
Dennis Mauricio Ocampo Chaguendo
Diseño desarrollo y aplicación de métodos cromatográficos
Noviembre - 2020
CONCEPTOS
PREVIOS
Conceptos previos
Los pesos atómicos y moleculares
Se expresan generalmente en términos de unidades atómicas de masa (uma). La unidad
atómica de masa se basa en una escala relativa en la que la referencia es el isótopo del
Carbono 12C, al cual se le asigna una masa de exactamente 12 uma.
1 𝐷𝑎𝑙𝑡𝑜𝑛 =1.66054 ×10− 24 𝑔 / 𝑎𝑡𝑜𝑚𝑜𝑠 12𝐶
1
Conceptos previos
Los pesos atómicos y moleculares
En espectrometría de masas, a diferencia de lo que ocurre normalmente en química, se
está a menudo interesado en la masa exacta m de los isótopos de un elemento o en la
masa exacta de los compuestos que contienen un grupo particular de isótopos. Así, se
puede tener la necesidad de distinguir entre las masas de compuestos tales como
CH 4
metano
C H4
12 1
m= 12.000 x 1 + 1,007825 x 4 = 16,031 Da
C H4
13 1
m= 13.00335 x 1 + 1,007825 x 4 = 17,035 Da
C H32H1
12 1
m= 12.000 x 1 + 1,007825 x 3 + 2,0140 X 1 = 17,037 Da
2
Conceptos previos
Masa / carga (m/z)
En espectrometría de masas, se utiliza la relación masa/carga de un ion atómico o
molecular. Este término se obtiene dividiendo la masa atómica o molecular de un ion m
por el número de cargas z que tiene el ion.
Debido a que la mayoría de los iones en
12
C1H4+ m/z = 16.035/1 = 16.035 espectrometría de masas tienen una carga
unidad, el término masa/carga a menudo
se reduce al término más adecuado de
masa. Estrictamente hablando, esta
13
C1H42+ m/z = 17.035/2 = 8.518 abreviatura no es correcta pero se utiliza
ampliamente en la bibliografía de
espectrometría de masas.
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ORIGENES
Espectrometría de Masas
Orígenes
Parábola espectrográfica construida por J.J. Thomson
La espectrometría de masas tiene su origen en los
experimentos desarrollados en la Universidad de
Cambridge en Inglaterra en 1897 por Joseph John
Thomson, él descubrió que descargas eléctricas en
gases producían iones y que estos rayos de iones
podían adoptar diferentes trayectorias parabólicas de
acuerdo a su masa cuando pasaban a través de campos
electromagnéticos.
4
Espectrometría de Masas
Orígenes Espectrómetro de masas de Francis William Aston
Uno de los estudiantes de
Thomson, Francis William Aston
diseño varios espectrómetros de
masas en los cuales los iones eran
dispersados por sus masas y
enfocados de acuerdo a su
velocidad. Esto permitió mejorar el
poder de resolución de masas y el
posterior descubrimiento de
isótopos de diferentes elementos
que están presentes en la
naturaleza. Thomson recibió el
Premio Nobel de Física en 1906 y
Aston el Premio Nobel de Química
en 1922.
5
FUNDAMENT
O
Espectrometría de Masas
Fundamento
Un espectrómetro de masas es un instrumento
que produce iones y los separa de acuerdo con
sus relaciones masa/carga, m/z.
Esteban, L (1993). La espectrometría de masas en imágenes. 6
Espectrometría de Masas
Fundamento
Componentes principales de los espectrómetros de masas
Q-TOF Shimadzu
7
SISTEMAS DE
ENTRADA DE
MUESTRA
Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada de muestra
La finalidad del sistema de entrada es la de permitir la introducción de una muestra representativa en
la fuente de iones con la mínima pérdida de vacío. Los espectrómetros de masas más modernos están
equipados con dos tipos de entradas, de sonda directa y entradas cromatográficas.
Entrada por sonda directa
Los líquidos y sólidos
no volátiles se pueden
introducir en la región
de ionización mediante
un soporte de muestra
o sonda, el cual se
inserta a través de una
cámara intermedia de
vacío.
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento Directo GC-MS
El caudal de las columnas capilares en general es
suficientemente bajo como para que la salida de la columna
pueda introducirse directamente en la cámara de ionización de
un espectrómetro de masas. La diferencia de presión es
compensada a través de la disminución del diámetro de capilar
entre la columna y la fuente de ionización para evitar
fenómenos asociados a la caída de presión.
La sensibilidad conseguida con el método
de acoplamiento directo es máxima, ya que
el 100 % de la muestra eluida del GC llega
directamente a la fuente de ionización.
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento Directo GC-MS
Separadores
Utilizados para columnas de relleno o empaquetadas , ya que en este caso las columnas manejan flujos habituales de
15 – 50 mL /min de gas portador que no son tolerados por el vacío de la fuente de iones.
1. Separador JET. Difusión diferencial: Aprovecha la inercia de las moléculas pesadas del analito, al salir por el
extremo capilar de la columna, con dirección a un tubo de mayor diámetro hacia la fuente de iónica.
GC MS
VACIO
10
Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento Directo GC-MS
Separadores
2. Efusión molecular diferencial: En este tipo de dispositivos se utiliza un tubo de vidrio poroso a través fácilmente las
moléculas o átomos pequeños de gas portador, conservando el analito hacia el MS.
GC MS
VACIO
11
Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento Directo GC-MS
Separadores
3 Separador de membrana: Se utiliza normalmente una membrana de silicona a través de la cual pasan compuesto
orgánicos solubles en ella, mientras que los inorgánicos como el gas portador, no pueden pasar por ser insolubles.
GC ATMOSFERA
MEMBRANA DE
SILICONA
MS
12
Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento Directo GC-MS
Separadores
4 Separador Open Split: El separador Open Split o división de flujo en régimen abierto opera por difusión diferencial en
un flujo de gas inerte a presión atmosférica (gas de purga) el cual suele ser helio, este mecanismo de separación suele
utilizarse para muestras muy concentradas.
GC MS
COLUMNA RESTRICTOR
CAPILAR
FLUJO REGULABLE DE
GAS DE PURGA
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento Directo LC-MS
Las técnicas que se utilizan actualmente para la introducción de muestras procedentes de un LC, se pueden
clasificar en dos grupos: Las que solo introducen la muestras a la fuente iónica del espectrómetro, y las que
además la ionización “blanda” de las misma
Grupo I. solo introducción Grupo II. solo introducción + ionización
PB (Particle Beam) o Haz de partículas TSP (Thermospray) o termonebulización
PSP (Plasmaspray) o nebulización en plasma
API (Atmospheric Pressure Ionisation) o técnicas de
ionización a presión atmosférica:
ES (Electrospray) electronebulización
APcI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) o
ionización química a presión atmosférica
Dynamic FAB (Dynamic Fast Atom Bombardment)
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento LC-MS
PB (Particle Beam) o Haz de partículas
Esta técnica permite introducir en la fuente iónica del MS un haz de moléculas neutras de la muestras, que puede
ser termolábil y no volátil, una vez eliminada la totalidad del disolvente mediante un sistema basado en difusión
selectiva.
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento LC-MS
TSP (Thermospray) o termonebulización
Thermospray es una fuente de ionización suave mediante la cual un flujo de disolvente de muestra líquida pasa a
través de una columna muy fina calentada para convertirse en una pulverización de finas gotitas de líquido. Como
una forma de ionización a presión atmosférica en espectrometría de masas, estas gotitas se ionizan luego a través
de un electrodo de descarga de baja corriente para crear un plasma de iones solventes.
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento LC-MS
ES (Electrospray) electronebulización
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento LC-MS
APcI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) o ionización química a presión atmosférica
Esta técnica consiste en una sonda provista de un nebulizador neumático, colocada en una cámara de nebulización
calentada, en la que se encuentra un electrodo en forma de aguja que produce una descarga eléctrica similar al
electroSpray.
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Espectrometría de Masas
Sistemas de entrada cromatográficos
Acoplamiento LC-MS
Dynamic FAB (Dynamic Fast Atom Bombardment)
A través de esta técnica se introduce la muestras en forma de flujo liquido normalmente de 1-20 uL /min. El flujo
penetra en forma liquida hasta la misma fuente iónica del espectrómetro , por medio de un capilar inerte de sílice
fundida que termina en una mezcla de material absorbente y/o calefacción para eliminar el exceso de solvente.
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FUENTE DE
IONES
Espectrometría de Masas
Fuentes de iones
Fuentes de impacto de electrones (EI )
Los electrones son emitidos por un filamento caliente de wolframio o de renio y se les acelera mediante la
aplicación de alrededor de 70 V entre el filamento y el anodo.
20
Espectrometría de Masas
Fuentes de iones
Fuentes de ionización química (CI = Chemical ionisation)
Se introduce un reactivo gaseoso en la región de ionización en una cantidad tal que la relación de concentración
entre el reactivo y la muestra sea casi exclusivamente con las moleculas de reactivo.
Uno de los reactivos más comunes es el
metano, que reacciona con electrones de
elevada energía para dar varios iones como
CH4+ , CH3+ y CH2+ . Los dos primeros
predominan y representan alrededor del 90%
de los productos de reacción.
21
Espectrometría de Masas
Fuentes de iones
Fuentes de ionización a presión atmosférica (API)
La Ionización a Presión Atmosférica (API) es una técnica de ionización blanda que, al actuar a presión atmosférica,
y no en alto vacío como es lo habitual en otras técnicas, consigue un altísimo rendimiento. Como interfase para
HPLC, tiene la virtud de aceptar todo el flujo procedente de un cromatógrafo líquido de alta presión convencional,
hasta 1 a 4 mL/min., lo que incide favorablemente sobre la sensibilidad del proceso LC-MS.
N22
VACIO
DESOLVATACIÓN
DESOLVATACIÓN
FUERZAS
FUERZAS EVAPORACIÓN
CULOMBIONAS
CULOMBIONAS IONICA
REPULSORAS
REPULSORAS
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Espectrometría de Masas
Fuentes de iones
Fuentes de ionización de campo (FI = Field ionisation)
En las fuentes de ionización de campo, los iones se forman bajo la influencia de un campo eléctrico elevado (108
V/cm). Tales campos se producen al aplicar altos voltajes (10 a 20 kV) a emisores especialmente construidos que
consisten en numerosas puntas finas que tienen diámetros menores que 1 μm. Estos emisores a menudo
adquieren la forma de un fino hilo de tungsteno (10 μm de diámetro) en el cual se han hecho crecer agujas o
pinchos microscópicos de carbón por pirólisis de benzonitrilo en un campo eléctrico elevado. El resultado de este
tratamiento es la aparición de centenares de micropuntas de carbón que emergen desde la superficie del hilo
EMISOR
MOLECULAS NEUTRAS
DEFORMACIÓN ORBITALES
EXTERNOS
PERDIDA DE ELECTRON POR EFECTO TUNEL Y
REPULSION DE ION RADICAL FORMADO
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Espectrometría de Masas
Sistemas de vacío
Fuentes de desorción de campo (FD = Field desorption)
Los métodos de ionización descritos requieren que los agentes de ionización actúen sobre muestras gaseosas.
Tales métodos no son aplicables a muestras no volátiles o térmicamente inestables. Se han desarrollado en las dos
últimas décadas un número de métodos de ionización de desorción para tratar este tipo de muestras . Como
consecuencia, actualmente se puede obtener información sobre espectros de masas de especies bioquímicas
delicadas y especies que tienen pesos moleculares superiores a 10 000 daltons.
DESORCIÓN CATODO RENDIJAS DE
(EXTRACTOR) ENFOQUE
IONIZACIÓN POR EFECTO TUNEL
1077 - 1088 V/cm
ANODO
ANODO
(EMISORES)
(EMISORES)
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Espectrometría de Masas
Fuentes de iones
Fuentes de bombardeo por átomos rápidos (FAB=Fast Atom Bombardment) o iones (SIMS = Secondary ion MS)
Al bombardear la superficie de una muestra sólida con un haz de iones primarios se origina la emisión de iones
secundarios característicos de la muestra. El análisis de estos iones secundarios por medio de un espectrómetro
de masas constituye la técnica SIMS muy utilizada para analizar superficies sólidas metálicas. Sin embargo la
técnica SIMS no ha sido muy utilizada para analizar muestras orgánicas por razones tales como su carácter
destructivo, la aparición de cargas superficiales al ser muestras eléctricamente aislantes, etc.
ANGULO OPTIMO
15 – 20 °
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Ventajas y desventajas
Fuentes de ionización
• Las fuentes por impacto de electrones son • La extensa fragmentación puede ser también un
adecuadas para el uso y producción de inconveniente cuando da lugar a la desaparición
corrientes de iones elevadas, con lo que se del pico del ion molecular, porque no se puede
obtienen buenas sensibilidades. establecer con facilidad la masas molecular del
analito.
• La extensa fragmentación y la consecuente
• Otra limitación de este tipo de fuentes es la
elevada cantidad de picos son también una
necesidad de volatilizar la muestra, lo cual
ventaja, ya que a menudo permite
podría ocasionar la degradación térmica de
identificaciones inequívocas de los posibles
algunos analitos antes de que se produzca la
analitos.
ionización.
Skoog, D., Holler, J., & Crouch, S. (2008). Principios de análisis instrumental (Sexta ed.). México D.F.: Cengage Learning Editores. 26
SISTEMAS DE
VACIO
Espectrometría de Masas
Sistema de vacío
Los principales tipos de bombas que se utilizan para conseguir el alto vacío en espectrometría de masas son las
difusoras y las turbomoleculares sin olvidar las mecánicas o rotatorias que son las que se necesitan para hacer los
vacíos preliminares que requieren las difusoras y las turbomoleculares para empezar a trabajar.
BOMBA TURBOMOLECULAR BOMBA DIFUSORA
ROTOR
ENTRADA DE
AIRE EYECTOR LATERAL EYECTORES
PREVACIO ACEITE MENOS
VOLATIL
CONEXIÓN A LA
REFRIGERACIÓN
PLACA DE
ACEITE CON
CALEFACIÓN
COMPONENTES VOLATILES
MOTOR
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Espectrometría de Masas
Sistema de vacío
Comparación
BOMBA TURBOMOLECULAR BOMBA DIFUSORA
Ventajas Ventajas
• Costo reducido • Alcanza régimen rápidamente
• Mantenimiento casi nulo • Posicionado en ángulo
• Relación de compresión alta • Menor necesidad de refrigeración
Inconvenientes Inconvenientes
• Riesgos de contaminación • Caras
• Posicionado vertical • Costos de averías
• Alcanza la situación de régimen • Riesgo de daños / contaminación
con lentitud • Vibraciones
• Mayor necesidad de refrigeración • Incompatible con gases corrosivos
• Relación de compresión baja
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ANALIZADOR
ES DE MASA
Espectrometría de Masas
Analizadores de masa
Analizadores de sector magnético
Los analizadores de sector magnético utilizan un imán permanente o un electroimán para hacer que el haz de
iones de la fuente se mueva en una trayectoria circular de 180, 90 o 60 grados. A continuación se muestra un
instrumento de sector de 90 grados en el que los iones, formados por impacto de electrones, son acelerados a
través de la rendija B hacia el tubo analizador metálico, que se mantiene a una presión interna de alrededor de 10-
7 torr.
29
Espectrometría de Masas
Analizadores de masa
Filtros de masas de cuadrupolo
Los espectrómetros de masa de cuadrupolo son normalmente más compactos, menos caros y más robustos que
los de sector magnético. También ofrecen la ventaja de emplear tiempos de barrido bajos (esto es, < 100 ms), lo
que es particularmente útil para realizar barridos de picos cromatográficos a tiempo real. Los analizadores de
cuadrupolo son actualmente los de utilización más frecuente.
• Resolución: 1 uma
• Rango de masas: 50 – 4000 m/z
• Velocidad de Escaneo: 4000 – 10000 unas/s
• Aplicaciones: Cualitativo y cuantitativo
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Espectrometría de Masas
Analizadores de masa
Analizador de trampa de iones (IT-MS, ion-trap MS o ITD, ion trap detector)
Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos pueden ser formados y
confinados durante largos períodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos. Se han
desarrollado varios tipos de trampas de iones que en general son cuadrupolos pero en el espacio que lo que hacen
es manipular iones y permitir hacer masas/masas.
• Resolución: 1 uma
• Rango de masas: 6000 m/z
• Velocidad de Escaneo: 13000 unas/s
• Aplicaciones: Cualitativo y cuantitativo
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Espectrometría de Masas
Analizadores de masa • Resolución: 10000
• Rango de masas: Ilimitado
Analizador de tiempo de vuelo (TOF, time of • Velocidad de Escaneo: 1000000 umas/s
flight) • Aplicaciones: Cualitativo
En los instrumentos de tiempo de vuelo (TOF),
los iones positivos se producen periódicamente
por bombardeo de la muestra con impulsos de
electrones, de iones secundarios o de fotones
generados por láser. Estos impulsos tienen
normalmente una frecuencia de 10 a 50 kHz y
un tiempo de vida de 0,25 μs. Los iones
producidos de esta manera son acelerados por
un impulso de campo eléctrico de 103 a 104 V
que tiene la misma frecuencia, pero retrasada,
que el impulso de ionización. Las partículas
aceleradas pasan entonces a un tubo
analizador de un metro de longitud sobre el
que noactúa ningún campo.
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Espectrometría de Masas
Analizadores de masa
Resonancia ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICRMS Fourier
transform ion cyclotron resonance mass spectrometer)
Los espectrómetros de masas de transformada de Fourier proporcionan relaciones señal/ruido superiores,
velocidades mayores y sensibilidad y resolución elevadas. Los espectrómetros de masas de transformada de
Fourier comerciales aparecieron en el mercado a principios de 1980 y actualmente los ofrecen diversos
fabricantes. La parte esencial de un instrumento de transformada de Fourier es una trampa de iones en la cual los
iones circulan en órbitas bien definidas durante largos períodos. Tales cavidades se construyen aprovechando el
fenómeno de resonancia de ion ciclotrón.
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DETECTORES
Espectrometría de Masas
Detectores
Detector de copa de Faraday
Consiste en un simple electrodo, normalmente en forma de copa o caja, que recibe el impacto de los iones a
detectar. Los iones se neutralizan por transferencia de electrones, y la señal se mide como una corriente analógica
igual o superior a la corriente iónica original, dependiendo de la forma del electrodo. Es un detector de baja
sensibilidad y gran sencillez. Puede trabajar a presiones relativamente altas, del orden de 10-4 mbar, y posee una
gran linealidad de respuesta. La mínima corriente detectable es del orden de 10-14 A.
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Espectrometría de Masas
Detectores
Multiplicador de electrones secundarios
Uno de los detectores que han sido más utilizados en espectrometría de masas, es el multiplicador de electrones
de dínodos. El cátodo y los sucesivos dínodos tienen superficies de Cu/Be de las que se emiten ráfagas de
electrones al ser alcanzadas por iones o electrones de elevada energía. Su funcionamiento puede verse en la figura
20a. El ión a detectar choca con el primer dínodo, provocando la emisión de un elevado número de electrones,
que van a incidir sobre el segundo dínodo. El proceso de multiplicación se repite sucesivamente en los demás
dínodos, obteniéndose al final del sistema una amplificación de señal del orden de 106 a 108.
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Espectrometría de Masas
Detectores
Detector "Channeltron“
Este detector es uno de los más utilizados hoy en día en espectrometría de masas para uso general. Es similar al
multiplicador de electrones clásico, con la principal diferencia de que no tiene múltiples dínodos discretos, sino
que está formado por un tubo de vidrio en forma de corneta, a veces terminado en forma de espiral o caracol
(figura 20b), cuyo interior está recubierto por un óxido de plomo semiconductor de composición y características
especiales.
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Espectrometría de Masas
Detectores
Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de centelleo)
Los iones procedentes del tubo de vuelo del espectrómetro de masas son desviados de su trayectoria mediante un
potencial eléctrico. El voltaje aplicado es de signo contrario a la carga de los iones que se quieran detectar, para
provocar su atracción y choque sobre el dínodo inicial. Este choque produce múltiples electrones que son atraídos,
a su vez, por un voltaje más positivo que el del dínodo, y aplicado sobre una pantalla fosforescente.
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Espectrometría de Masas
Detectores
Detectores multicanal
Este tipo de detectores reúnen la ventaja de los antiguos sistemas de fotoplacas, de ser capaces de detectar
simultáneamente una amplia zona espectral, lo que aumenta enormemente el tiempo de observación de cada ion,
con la mayor sensibilidad, estabilidad, capacidad de amplificación, etc., de los modernos sistemas multiplicadores.
Ello conduce a una sensibilidad aumentada en muchos órdenes de magnitud. Existen distintas denominaciones de
este tipo de detectores tales como: Multiple Channel Detector o Multiple Channel Detector/Multiplier Array
Detector/Microchannel Multipliers - Multichannel Photo Diode Array
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TANDEM
GC-MS
Espectrometros de masas en tandem
La cromatografia de gases tambien se acopla a espectrometros de masas en tandem o a espectrometros de
masas de transformada de Fourier para tener asi sistemas GC-MS-MS o GC-MSn. Estas son herramientas en
extremo potentes para identificar componentes de mezclas.
Skoog, D., Holler, J., & Crouch, S. (2008). Principios de análisis instrumental (Sexta ed.). México D.F.: Cengage Learning Editores. 39
LC-MS
Analizadores de masas QQQ
En años recientes se volvio posible acoplar dos o mas analizadores de masas para formar espectrometros de
masas en tandem
Skoog, D., Holler, J., & Crouch, S. (2008). Principios de análisis instrumental (Sexta ed.). México D.F.: Cengage Learning Editores. 40
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APLICACIONE
S
Aplicaciones
Análisis cualitativo: identificación de compuestos puros
El espectro de masas de un compuesto
puro proporciona diversos tipos de datos Espectros de masas de impacto electrónico de etilbenceno
que son útiles para su identificación. El
primero es el peso molecular del
compuesto y el segundo es su fórmula.
Además, el estudio de los modelos de
fragmentación que se pone de manifiesto
en el espectro de masas a menudo
proporciona información sobre la
presencia de varios grupos funcionales.
Finalmente, la identidad real de un
compuesto puede establecerse a menudo
por comparación de su espectro de masas
con los de compuestos conocidos hasta
llegar a una total coincidencia.
Skoog, D., Holler, J., & Crouch, S. (2008). Principios de análisis instrumental (Sexta ed.). México D.F.: Cengage Learning Editores. 41
Aplicaciones
Análisis cuantitativo: determinación de concentraciones moleculares
La espectrometría de masas ha sido
ampliamente utilizada en la Análisis cuantitativo de medicamentos veterinarios en espectrómetro de masas de triple
cuadrupolo SHIMADZU LCMS-8050
determinación cuantitativa de uno o más
componentes en sistemas complejos
orgánicos (y a veces inorgánicos) tal como
los que se encuentran en las industrias
del petróleo, farmacéutica y en estudios
de problemas ambientales. Normalmente,
tales análisis se llevan a cabo pasando la
muestra a través de una columna
cromatográfica y por el espectrómetro.
Con el espectrómetro se obtiene un valor
adecuado de m/z, entonces se registra la
corriente de iones en función del tiempo.
42
Gracias
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Tel. 316-6409490
