CROMATOGRAFIA
LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION
INTRODUCCION
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución
de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una
estacionaria y otra móvil. a cual tiene aplicación en todas las ramas de la
ciencia; es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
CAMPO DE APLICACIÓN
La cromatografía liquida de alta resolución es una técnica instrumental utilizada
ampliamente en los laboratorios de bioquímica y química analítica, por su
excelencia cualitativa y cuantitativa, siendo por tanto su comprensión.
En los problemas relacionados con la contaminación ambiental, la HPLC se utiliza
para la contaminación de algunos pesticidas (insecticidas, larvicidas, herbicidas,
etc.).
El bioquímico con frecuencia en un campo de investigación es el que plantea el problema de analizar compuestos volátiles y de alto peso
molécula. Por ejemplo, se han efectuado determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos, nucleósidos) por
cromatografía de intercambio iónico.
El análisis de medicamentos es también una aplicación muy interesante, la determinación de los componentes activos de una tableta
analgésica. También el análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc.
Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc.
Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésico
Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores,
colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos
TIPOS DE HPLC
Cromatografía de fase normal
La cromatografía de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo de
sistema HPLC utilizado en el campo de la química, y se caracteriza por separar los
compuestos sobre la base de su polaridad. Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar
y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar
Cromatografía de fase inversa (o reversa)
La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin
ninguna especificación adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio
de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria
apolar. La fuerza conductora en la unión del compuesto a la fase estacionaria es la
disminución del área del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto
hidrofóbico está dominado por el aumento de la entropía, y la consecuente disminución de
la energía libre, asociada con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar
Cromatografía de exclusión molecular
La cromatografía de exclusión molecular, también conocida como cromatografía
por filtración en gel, separa las partículas de la muestra en función de su tamaño.
Generalmente se trata de una cromatografía de baja resolución de forma que se
suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificación. También es muy útil
para la determinación de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las
proteínas purificadas.
Cromatografía de intercambio iónico
En la cromatografía de intercambio iónico, la retención se basa en la atracción electrostática
entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la
misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna.
Algunos tipos de intercambiadores iónicos son: i) Resinas de poliestireno, ii)
intercambiadores iónicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de
tamaño de poro controlado.
Cromatografía basada en bioafinidad
Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de las sustancias biológicamente activas
de formar complejos estables, específicos y reversibles.
Cromatografía líquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes
(DHPLC)
Se trata de un método que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi
totalmente en desuso debido al auge de la secuenciación), que permite detectar la
presencia de variaciones en el ADN aunque no se determinan específicamente
cuáles. En este caso, se utiliza la técnica cromatográfica para la detección de
heterodúplex de ADN, en lugar de utilizar un gel para correr las moléculas de ácidos
nucleicos
EFICACIA DE LA COLUMNA HPLC
La eficacia de la separación de los componentes de una mezcla en una columna cromatográfica guarda
una estrecha relación con la forma y la separación de los picos cromatográficos que se reflejan en el
cromatograma
La observación de los picos cromatográficos muestra una gran semejanza con las curvas de error normal o
Gaussianas, lo cual puede explicarse de la forma siguiente: durante el desplazamiento por el interior de
una columna cromatográfica, una partícula individual de analito experimenta miles de transferencias entre
las fases móvil y estacionaria.
El tema de la eficacia de un sistema cromatográfico se aborda desde dos puntos de vista: la teoría de
platos y la teoría cinética, que se consideran brevemente a continuación.
Teoría de los platos en Cromatografía
Considera que una columna cromatográfica está constituida por una serie de capas estrechas, discretas
pero contiguas, denominadas platos teóricos, en los cuales se establece el equilibrio de distribución de
cada soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Podemos definir, entonces, plato teórico como la longitud de una columna en la que el soluto
experimenta un equilibrio completo entre las dos fases. El número de platos teóricos N de una
columna de longitud L será:
la altura de plato teórico H se puede definir en función de dichos parámetros como:
Se puede deducir que el número de platos teóricos se relaciona con parámetros que
pueden deducirse fácilmente de un cromatograma:
Conviene recordar que el plato teórico es una construcción artifical que nos permite
explicar la forma de los picos y la velocidad de desplazamiento a través de la
columna.
Teoría cinética de la cromatografía
Uno de los factores que afectan a la eficacia es el ensanchamiento de banda.
La teoría cinética de la cromatografía ofrece una explicación más realista que la teoría
de platos y permite razonar cuantitativamente las formas y también los anchos de las
bandas.
Los factores que contribuyen a la anchura de banda son:
Difusión en remolino o difusión de Eddy:
las moléculas en disolución pueden atravesar la columna siguiendo trayectorias de
distinta longitud con tiempos de retención diferentes
Difusión longitudinal:
desde la zona central de la banda, en la que la concentración de solutos es mayor,
hacia los extremos de la banda, donde la concentración es menor; es inversamente
proporcional a la velocidad de flujo de la fase móvil.
Resistencia a la transferencia de masa entre la fase móvil y la fase estacionaria:
ya que el equilibrio de distribución no es inmediato y no tiene el tiempo suficiente
para establecerse, por lo que es proporcional a la velocidad de flujo.
Estos tres factores se relacionan con la altura de plato mediante la ecuación de van Deemter:
Si representamos la altura de plato frente a la velocidad de flujo de la fase móvil, vemos
que existe una velocidad de flujo óptima para la cual la altura de plato se hace mínima y la
eficacia es mayor:
Resumimos los factores que afectan al ensanchamiento (permiten optimizar el valor de H):
Diámetro de las partículas: que constituyen el relleno de la columna: al aumentar el
diámetro aumenta la difusión en remolino
Diámetro de la columna: al disminuir el diámetro de la columna se disminuye la
contribución de la difusión de remolino a la altura de plato teórico.
Coeficiente de difusión: su influencia es detectable en el caso de los gases, cuando la
velocidad de flujo no es muy grande y el término de difusión longitudinal es determinante
(aumenta con la temperatura); en el caso de los líquidos su efecto es mínimo.
Velocidad de flujo de la fase móvil, ya que las velocidades suelen ser lo
suficientemente elevadas como para que el término de transferencia de masar sea el
que controla la eficacia de la columna.
Otros factores, como la naturaleza de la fase móvil (su viscosidad, por ejemplo),
el tamaño de la muestra o la rapidez de la inyección (una inyección lenta conduce
al ensanchamiento de banda y disminuye la eficacia).
