EXPRESIÓN MEJORADA Y PURIFICACIÓN DEL
RECEPTOR SIGMA 1 FUSIONADO A LA PROTEÍNA
DE UNIÓN A MALTOSA MEDIANTE LA
ALTERACIÓN DE LA SECUENCIA DEL ENLAZADOR
Seminario de enzimología
Estudiante: Sofia Patricia Papel Jacho
N
*Fusión entre S1R y proteína de unión a
maltosa (MBP) en Escherichia coli.
*Enlace (0-5 residuos de Ala – variantes) =
MBP - S1R activo/ expresión mejorada.
*Enlazador 4-Ala posee mejores expresiones
(MBP- 4 A –S1R) en E.C. B834-pRARE2
¿CÓMO SE
LOGRÓ ESTO?
*Se desarrollo una purificación de 3 pasos.
*Uso de Triton X-100 y n -dodecil-beta-D-
maltopiranósido
*Cromatografía, filtración de gel.
¿QUE DIO COMO
RESULTADO?
*3,5 mg de proteína de fusión purificada por L de medio
de cultivo bacteriano.
*MBP-4A-S1R purificado mostró una purificación de 175
veces a partir del lisado celular
*Estabilidad durante la concentración y el ciclo de
congelación-descongelación.
¿ Qué es el (S1R)? ¿Por qué es importante?
*Proteína ubicada en la
membrana de RE Implicado en señalización, trans.
neurológicos, accidentes
cerebrovasculares
Interactúa con la progesterona
y testosterona (end). *Regulación de homeostasis de calcio
en mit., síntesis de hormonas
Chaperona: interactúa con en
canal NA+ *Implicados en estímulos – respuesta
(dolor, aprendizaje, psicosis
Interactúa con cocaína,
anfetaminas, metanfetaminas, *La secuencia primaria está altamente
alucinógenos (exo). conservada entre diferentes mamíferos,
con> 90% de identidad.
PROBLEMA SOLUCIÓN
*Clonación de genes de S1R de * La (MBP) ayuda a que varias proteínas
de membrana puedan promover su
roedores y seres humanos.
mayor expresión y purificación.
*Expresado de Escherichia coli, *Además facilita la incorporación de
proteínas a la membrana bacteriana.
Saccharomyces cerevisiae
*Es decir la unión de MBP – S1R con
* Redimiendo de proteína funcional una secuencia enlazadora podría
expresarse en E. coli BL21 (DE3).
es bajo (0,2 mg/l de cultivo de E.
Coli).
*Es así que S1R se puede obtener de
forma funcional pero con un rendimiento
de 0.6 mg.
Sin embargo, a partir de un detergente de extracción y
protocolos de purificación para MBP-S1R mejorados y
LA CEPA UTILIZADA PARA LA EXPRESIÓN + LA
REGIÓN ENLAZADORA indicada PUEDE
ALCANZAR UNA EXPRESIÓN MEJORADA.
REACTIVO
S
* Tampones a partir de agua
desionizada y destilada.
* Filtrado a través de un filtro de
0.8 um.
CLONACIÓN:
*Plásmido que codifique S1R de cobaya.
*MBP para la unión de S1R se fije al plásmido.
*Enlazador para la unión de MBP – S1R.
*TEV: sitio de reconocimiento de proteasa del virus del
grabado de tabaco
*mutagenizado para contener de 0-5 residuos de Ala.
*PCR: uso de polimerasas, cebadores, oligonucleótidos, etc.
* PCR finalizado: aislación de plásmidos y secuenciación para
analizar quienes tenían el enlazador.
CEPAS DE CLONACIÓN:
*Plásmido progenitor MBP –
TEV –S1R.
*Nuevos plásmidos con
enlaces variantes.
*Trasformados en cepas E. *Plásmido pRARE2, aislado y
luego enviado a cepas
Coli. apropiadas.
*Medios de cultivo + 34ug/ml
*Medios de cultivo + 200ug/ml de cloranfenicol.
OTOCOLOS DE EXPRESIÓN:
*Inóculos cultivados en 3ml *Inóculos cultivados en
de medio no inductor de botellas de soda, con 480 ml
MDAG. del medio y 5SM.
*Cultivo de 3ml llevado a 100
ml de m. *Crecimiento a 37 C°,
*Crecimiento a 25 C°, agitación.
agitación.
*IPTG.
*Expresión de proteínas - marcaje de
selenometionina 5SM con azúcar
OTOCOLOS DE EXPRESIÓN:
• Finalmente las células se recolectaron por
centrifugación.
• Almacenamiento -80 °C
• Se guardo 0.1 g de pasta celular para análisis
de expresión / electroforesis.
Tamizado de solubilización de
detergente:
*Suspendió 0.2 de pasta celular
*Se sometido a ultrasonidos en hielo durante 15 m
*Centrifugado 1 hora /75.000 rpm/ 4-8 °C
*Se suspendió la membrana (sedimento)/ tampón
tris-HCL
*Mediante un ensayo bicrónico (BCA)compatible
con el agente reductor se midió la proteína total..
*En lugar de diluir con tampón, se uso agua
desionizada.
Tamizado de solubilización de
detergente:
• PREPARO PANTALLA DE
DETERGENTES(N) + Triton X-100 (5% o 10%
p / v) = mayor eficacia de extracción de MBP-
TEV-S1R.
• Luego se centrifugo 1 hora/ 5.500 rpm.
• El sobrenadante ( PROTEINA
SOLUBILIZADA) y el sedimento se
Tamizado de solubilización de
detergente:
*La eficacia de solubilización se da comparando visualmente
el sedimento y lo solubilizado.
• Si esta más del 50% de la proteína en la fracción S, la
combinación de detergente y la concentración se
consideraron aceptables
“ESTO OPTIMIZA LA EFICIENCIA DE EXTRACCIÓN Y
PURIFICAIÓN”
Conclusiones:
•El rendimiento de MBP-S1R activo depende del hospedador de
expresión de E. coli y la longitud del enlazador de dominio.
•Escherichia coli B834-pRARE2 y un enlazador 4-Ala dieron el
mayor rendimiento de proteína activa.
•La proteína de fusión se puede purificar con alto rendimiento en una
mezcla de Triton-X100 y DDM.
•La proteína de fusión purificada tiene una alta actividad de unión a
ligando específica.
