MICROSCOPIA
Dr. José Antonio Gutiérrez Bustamante
Departamento de Morfología Humana
HISTORIA DEL MICROSCOPIO
ANTHONY VAN LEEUWENHOEK (1632-1723)
ZACHARIAS JANSSEN (1588-1628)
Microscopio simple usando dos
Primer microscopio lentes 1674
EVOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO
Microscopio simple aquel
que utiliza un solo lente de
aumento. Es el microscopio
más básico. Ejemplo la
lupa.
Tipos de microscopio
• Microscopio fotónico
• Microscopio electrónico
Microscopia fotónica
Usa como fuente luminosa luz blanca o
ultravioleta.
Tipos de microscopios fotónicos según
sea el tipo de luz e iluminación que
utilicen; el de campo claro, campo
oscuro, contraste de fases,
fluorescencia, luz polarizada,
estereoscópica e interferencias de
Nomarski y Jamin Lebedeff.
Microscopios fotónicos
Microscopio de campo claro
• La imagen muestra
estructuras iluminadas
(células, microorganismos
y otros) sobre un fondo
también iluminado. Se
utiliza sobre todo para la
observación de muestras
teñidas o contrastadas y
ése es precisamente su
uso más frecuente el
laboratorios.
Microscopio de campo
oscuro
• La imagen proyecta
estructuras brillantes e
iluminadas (células y
diversos
microorganismos) sobre
un fondo oscuro (negro).
Se emplea para analizar
células sin teñir,
probablemente vivas
dado que no es necesario
procesarlas.
Microscopio compuesto Recorrido
de la luz
Aumento Imagen
visualizada
ojo
Lente ocular
Imagen intermedia
(invertida respecto
a la muestra)
Lente objetivo
Muestra
Ninguno Condensador
Fuente de luz
Microscopio óptico
SISTEMAS DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
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Sistema Mecánico
Tubo
Platina Brazo
Píe
Sistema mecánico (ajuste)
Anillo de ajuste
de los oculares
Tornillo que
permite mover
el cabezal
Tornillos del
condensador
Tornillos
Palanca de reguladores de
cierre del la platina
diafragma
SISTEMA DE ENFOQUE
Freno
Tornillo
macrométrico
Tornillo
micrométrico
PLATINA
Pinza
Escala
PARTE ÓPTICA
Sistema de
iluminación:
fuente de luz,
condensador y
diafragma
Lentes: objetivos
y oculares
SISTEMA DE ILUMINACIÓN: FUENTE
DE LUZ
Es una lámpara
halógena de
intensidad graduable
Interruptor
En el exterior puede
tener un filtro
Filtro
Interruptor y graduación de
la luz
Lámpara
Lentes oculares
Aumento
OCULARES: 10x; 15x; 20x
LENTES: OBJETIVOS
• Están colocados en el
revólver
• Tienen un sistema de
amortiguación
• Un anillo coloreado
indica los aumentos
• Son de 4, 10, 20, 40,
60, y 100 (inmersión)
aumentos
Lentes objetivos
OBJETIVOS
Rojo
4x
Amarillo
10x
Blanco
100x Azul
40x
Amortiguación
Diafragma y condensador
Condensador
Diafragma
DIAFRAGMA Y CONDENSADOR
• Condensador:
concentra la luz de la
lámpara en un punto de
la preparación
• Diafragma o iris
(está dentro del
condensador):si se cierra
mejora el contraste.
PARÁMETROS ÓPTICOS
Aumento
Poder de
resolución
Nº de campo
Profundidad de
foco
Contraste
AUMENTO
Se calcula multiplicando el aumento
del objetivo por el aumento del ocular
Ejem: Objetivo de 40 X; ocular 10X
Aumento = (40) (10) = 400 X
PODER DE RESOLUCIÓN
Distancia con la que dos puntos se
distinguen
Mayor, cuando menor es la longitud
de onda
Mayor, cuanto mas grande es la
apertura numérica
Mayor, con aceite de cedro
MICROSCOPÍA DE
CONTRASTE DE FASES
VENTAJAS
Examina la estructura de los
organelos
Observa el movimiento de los
organelos, núcleo y
mitocondrias
Observa células vivas en cultivo
DESVENTAJA
Observa células individuales
Células epiteliales 20 x
MICROSCOPIA DE
FLUORESCENCIA
Células epiteliales 200 x
Aplicaciones
Detecta proteínas
específicas
Revela organelos dentro de
la célula
Limitaciones
En cortes celulares finos
Utiliza fijadores que
destruyen la
antigenicidad de las
proteínas
Microscopio de fluorescencia
• La imagen de las zonas o puntos que quedan
marcados con fluorescencia es de un color
brillante. Por lo general, las estructuras
aparecen poco iluminadas, lo cual permite
que la marca fluorescente resalte y permita
observarse con facilidad. Se emplea para
detectar compuestos fluorescentes que se
hallen el los tejidos. Su ejemplo más
difundido es el de fines diagnósticos y de
investigación.
Microscopio de luz polarizada
• El empleo de este tipo de luz permite
diferenciar en la muestra zonas isotropas,
que se muestran en la imagen como zonas
oscuras, de anisotropas y aparecen en la
imagen como zonas claras. Permite
también detectar la presencia de cristales.
Empleada en ciencias biomédicas.
Microscopio de interferencia
de Nomarsky
• Este tipo de microscopio
permite observar una
imagen de relieve de las
estructuras como su
característica principal.
Es un sistema poco
empleado por su costo.
Microscopio de interferencia
de Jamin Lebedeff
• La principal característica
de la imagen de este
microscopio es que se
observa en colores,
aunque la muestra no se
haya teñido. Se utiliza
para el análisis de la
composición y el peso
celular, pero es de uso
restringido.
ERNST RUSKA
El microscopio
electrónico de
transmisión (T.E.M.)
consiguió aumentos
de 100.000 X. Fue
desarrollado por
Max Knoll y Ernst
Ruska en Alemania
en 1931
PRIMER MICROSCOPIO
ELECTRONICO
Utilizó un haz de
electrones en lugar
de luz para enfocar
la muestra.
Posteriormente, en
1942 se desarrolla el
microscopio
electrónico de
barrido (SEM).
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO DE BARRIDO
Obtiene una imagen
tridimensional
Tamaño pequeño y
sencillo
Utiliza los e-
dispersos a partir
de la superficie de
la muestra
M.E. DE BARRIDO
Glóbulo blanco
M.E. DE TRANSMISIÓN
Similar al óptico
pero de mayor
tamaño
Complejo e
invertido
Utiliza
electrones que
atravieza la
muestra
Bacilos en división
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE
TRANSMISIÓN
• En esencia, el MET es un tubo de
rayos catódicos en el que se crea
un vacío mediante bombeo
constante. Los electrones se
generan en el cañón, desde el
cátodo, que es un filamento de
tungsteno calentado por corriente
eléctrica; luego se emiten
electrones, atraídos y acelerados
mediante una diferencia de
potencial elevada, lo que origina
un haz monoenergético y
monocromático. Este haz se
enfoca mediante campos
electromagnéticos que actúan
como una lente condensadora.
Microscopio de efecto túnel
• Este sistema basa su funcionamiento en un
efecto cuántico, denominado efecto túnel,
que se da en distancias menores a la
milmillonésima parte de un metro (10-9m =
1 nm, un nanómetro). El control de este tipo
de fenómeno es lo que nos permite hacer
topografía de superficies a nivel atómico.
COMPARACION
Técnicas de coloración
Coloración:
proceso
mediante el cual
un cuerpo es
teñido por una
sustancia
colorante, sin
perder el color
cuando es lavado
con el disolvente.
Tipos de coloración
Ortocromáticas: los tejidos adquieren un
color igual al colorante .
- Metacromáticas: componente celular se
tiñe con un color diferente.
Métodos de coloración:
- Coloración directa: existe afinidad entre el colorante y el objeto.
- Coloración indirecta: requiere la intervención de mordientes.
- Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta su
punto óptimo.
- Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y
luego se elimina el resto del colorante por medio de
diferenciadores.
- Coloración simple: se colorean algunos elementos del
preparado.
- Coloración combinada: colorea los elementos nucleares y
citoplasmáticos .
- Coloración panóptica: coloración combinada realizada
sucesivamente por colorantes neutros (May-Grünwald-Giemsa).
- Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan
todos los colorantes neutros que se necesiten.
Coloración simple
Colorantes: reciben esta denominación las
sustancias que pueden conferir color a otros
cuerpos.
Clasificación de los colorantes:
Según su origen :
COLORANTES NATURALES:
- Animales carmín
- Vegetales hematoxilina, orceína, azafrán
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS :
- Ácidos: eosina o eosinato de sodio. Son colorantes
citoplasmáticos.
- Básicos: azul de metileno. Son colorantes nucleares.
- Neutros: Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: Sudán lll, rojo escarlata.
FIJACION
La fijación tiene por objeto matar las
células y conservarlas.
Es un método histológico destinado a
obtener preparados duraderos que
conservan la estructura morfológica y
química de las células y tejidos al
estado vivo
CUALIDADES DE UN FIJADOR
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las
células.
2. Poseer alto poder de penetración.
3. Conservar, los detalles estructurales que
presentaban in vivo.
4. Permitir el empleo de los procedimientos
necesarios para su observación posterior .
5. Impedir la desaparición de los elementos
solubles durante la fijación o después de ella.
6. No producir estructuras artificiales.
7. No retraer los tejidos.
TIPOS DE FIJADORES
Fijadores Químicos:
Fijadores simples: Constituido por una sola sustancia
química
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%.
c) Alcohol metílico
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%,
e) Bicromato de potasio al 3-5%.
Fijadores compuestos: Utiliza dos o mas fijadores
simples
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-
acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
e) Liquido de Bouin alcohólico.
Fijadores Físicos:
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
