PCR
Keny Davi Alvarado Quiroz
Sensibilidad
Específica
• Rápido
Gran n° de Copias • Económico
Primers • Delimitan longitud
Ciclos Repetitivos • 3 Temperaturas
CARACTERÍSTICAS DE
AMPLIFICACIÓN
Dirección
Mismas reglas de la Replicación
5’ – 3’
ADN molde Complementariedad Cadena Paralela
REQUERIMI
ENTOS DE
LA PCR
Taq Polimerasa mas
usada
Polimeriza DNA molde
Otra cadena
Termo resistente
Concentración 1 a 2.5u
1000nt x min
Cantidad suficiente 25 –
40 ciclos
DNA POLIMERASA
Baja concentración
ADN
Fidelidad de la
amplificación del
Alta concentración
productos
inespecíficos
Amplificación de
DNA MOLDE
Teóricamente 1 moléculas de DNA
Extracción de Ac. cDNA 25 a
RNA DNA 300ng Optimizar
Nucleótidos 100ng
Diluciones del
Calidad Adecuada Paso Previo Ciclos iniciales 1/10,1/25, 1/50,
1/100 y 1/200
Retrotranscripción dsDNA
DESOXINUCLEÓTIDOS
TRIFOSFATO (dNTPs)
dATP,
dCTP,
Concentración Optima >200ug <50ug
dGTP,
dTTP,
Genera 6.5 a 25 ug Incorporaciones
50 – 200uM Insuficientes
DNA erróneas
BUFFER
pH, concentración de Sales
pH 8,4
Tris HCl y KCl
ION MAGNESIO – CLORURO
DE MAGNESIO
Cofactor esencial
Optimizada
de DNA Concentración Exceso Baja
experimental
polimerasa
Amplificación Disminución
1 – 2.5 mM
Inespecífica producto
INICIADORES/PRIMERS
Concentración
0.3 – 1uM
Exceso
Productos no específicos
Baja
Terminen los iniciadores antes finalizar los ciclos de la PCR
INICIADORES
Evitar más de tres
extremo 3’ las últimas
18-30 pb. GC 60%/40%. repeticiones
bases sean G o C.
consecutivas
Temperatura de fusión Exonico
Se debe evitar la (Tm), se calcula con • RNA
complementariedad base en la siguiente 100 a 1000pb – 200 a
entre la pareja de fórmula: 500 pb
iniciadores • Tm = 4(G+C) + 2(A+T)
ADITIVOS
DMSO Glicerol Detergentes no BSA Betaina
• Disminuye la • Incrementa la iónicos • Amplificar ADN • Mejora la
estructura secundaria estabilidad térmica • Estabilizan a la Taq antiguo o muestras amplificación de los
del ADN de la enzima polimerasa e inhiben de ADN con fragmentos
inhibidores de PCR
la formación
como la melanina
Comerciales
estructuras
secundarias
Des
n at u
rali
z ac
ión
Cic
Des Am lo de
nat plif
ura icac
liza ión
ció
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Ali
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ció
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ESQUEMA DE LA PCR
Am
p lific
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nF
ina
l
Alm
a c en
am
ien
to
DESNATURALIZACIÓN
Calentamiento
94 y 96 °C
Romper los puentes de hidrógeno
Cadena queda como molde
ALINEACIÓN
Alinean los iniciadores a sitios específicos complementarios
Baja la temperatura entre 40 y 60 °C
Unión (alineamiento) de los iniciadores.
ELONGACIÓN
Sintetiza una nueva cadena en sentido 5’ a 3’
Temperatura, por lo general a 72 °C, Temperatura óptima
La polimerasa se une a los iniciadores y comienza la ADN replicación.
CANTIDAD DEL PRODUCTO
SENSIBILID
AD DE LA
TÉCNICA
100?
ANTES DE EMPEZAR
Esterilizar el material
Etiquetar todo el material
Determinar las condiciones de la PCR
Limpiar el área de trabajo
Descongelar todos los reactivos en baño de hielo y mezclarlos perfectamente.
Únicamente la enzima se mantiene en el congelador
Programar el termociclador.
DESNATURALIZACIÓN
INICIAL
Entre 94 y 96
°C durante 5-10
Se determinan minutos.
de acuerdo a
ADN y de la
ADN
polimerasa
CICLOS DE LA PCR
25 y 35 veces
DESNATURALIZACIÓN
Alto contenido de
guaninas y citosinas
se recomienda
94 ºC durante 30 aumentar el tiempo o
segundos a 1 minuto la temperatura.
ALINEAMIENTO
Alineamiento oscila entre 45 y 65 ºC durante
un tiempo entre 30 segundos y 1 minuto
EXTENSIÓN
30 segundos a 1
minuto
Tiempo de extensión
depende de la
longitud del
Realiza a 72ºC fragmento a
porque es la amplificar
temperatura a la cual
la Taq polimerasa
alcanza su mayor
actividad.
EXTENSIÓN FINAL
Sintetizar todos los
fragmentos que
pueden haber
Al terminar los quedado
ciclos, se realiza una incompletos.
última extensión de
aproximadamente 5
minutos a 72 ºC
RECOMENDACIONES
Control Negativo, Control Positivo
Materiales consumibles, nuevos y estériles
Pipetas y Áreas exclusivas para PCR
Hacer Alícuotas de todos los reactivos
Concentraciones sean las que se establecieron
No más de 40 ciclos porque los productos inespecíficos
Fase estacionaria, la cantidad de sintetizado es suficiente
APLICACIONES
Biotecnología
Ecología
Evolución
Biología de la conservación
Arqueología,
Patología
Medicina forense
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Ventaja
• Generar millones de
copias Desventaja
• Estandarizar la técnica
ACTIVIDADES
COMPLETE LOS CUADROS CON LOS
COMPONENTES QUE SE NECESITAN
PARA UNA PCR EXITOSA. DE FALTAR
ALGÚN COMPONENTE AÑÁDALO
A CONTINUACIÓN SE PRESENTAN
CUADROS CON LAS ETAPAS DE LA PCR,
INDIQUE LOS
NOMBRES DE CADA ETAPA Y REDACTE
LOS SUCESOS QUE OCURREN EN CADA
FASE DE ESTA TÉCNICA IN VITRO.
OBSERVE LA GRÁFICA DE
AMPLIFICACIÓN DE
PRODUCTO DE UNA PCR Y
COMENTE
EN LOS SIGUIENTES GRÁFICAS, INDIQUE LOS PASOS DEL
PROTOCOLO DE PCR Y DIGA SI
HUBIESE ALGÚN ERROR EN ESTE PROTOCOLO, CORRIJA LOS
ERRORES DE SER ENCONTRADOS.
