IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE

DE Colletotrichum RESPONSABLE
DE LA ANTRACNOSIS EN LA
MORA DE CASTILLA EN LA
REGIÓN CAFETERA.

MARTA L. MARULANDA A., LILIANA

ISAZA V., ANA MARIA RAMIREZ T.

CRISTHIAN RAMIREZ
• La antracnosis, causada por diferentes especies del género
Colletotrichum, es una enfermedad que ocasiona pérdidas entre 53%
y 70% en cultivos de mora (Rubus glaucus) en Colombia.
• Para el control de esta enfermedad se requiere conocer la
sintomatología en los cultivos e identificar y caracterizar el agente
causal.
• Se llevó a cabo la colecta, cultivo y aislamiento del hongo, obtenido
en cultivos de los departamentos de Risaralda, Caldas y Quindío, se
inició la caracterización de 7 aislamientos de Colletotrichum spp,
mediante la utilización de marcadores ITS (Internal Transcribed
Spacers), y la evaluación de la patogénicidad de los aislamientos.

RESUMEN
• Los frutales tropicales se perfilan como una de las
mejores opciones en la agricultura Colombiana por el
crecimiento de la demanda nacional e internacional que
se ha reportado en 3.75% anual en los últimos cuatro
años y por la activación de la industria post-cosecha
(jugos, mermeladas, etc.), cuya demanda es suplida en la
actualidad por importaciones (Rodríguez, 2002).

INTRODUCCIÓN
• La especie Rubus glaucus, conocida comúnmente como
mora de castilla, ha sido identificada como uno de los
frutales con mayor potencial de desarrollo en la zona
Andina colombiana.

INTRODUCCIÓN
• En los últimos años el cultivo de la mora ha presentado
numerosos problemas fitosanitarios. La antracnosis,
causada por Colletotrichum spp, ha alcanzado una
incidencia promedio de 52,9% en los cultivos de la zona
cafetera (Botero y col, 2002).

INTRODUCCIÓN
• Las lesiones usualmente se inician en la porción basal de
las espinas y en los sitios de inserción de las ramas, los
pecíolos y los pedúnculos, posteriormente se produce el
secamiento y la muerte de la planta (Cedeño y col, 1991).
• Puede encontrarse más de una especie atacando frutos u
otros órganos de un mismo hospedante (Freeman, 2000).

INTRODUCCIÓN
• En condiciones de invernadero también produce lesiones
en el estolón y en los frutos, causando importantes
pérdidas de la cosecha (Smith y col, 1987).
• Otras investigaciones en Rubus glaucus en el Valle del
Cauca después de analizar los aislados colectados, con
secuencias ITS (Internal Transcribed Spacers) de manera
preliminar concluyen que el agente causal de la
antracnosis es Colletotrichum acutatum (Alvarez y col,
2006).

INTRODUCCIÓN
• Para el control de la enfermedad es necesario conocer la
sintomatología y las características del agente causal, en
vista de los pocos estudios realizados en el Eje cafetero
en mora de castilla, se pretende muestrear, aislar y
caracterizar morfológica y genéticamente el hongo en
diferentes cultivos de mora con y sin aguijón en los
departamentos de Caldas, Quindío y Risaralda.

INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS
• Se obtuvieron muestras de hojas, ramas y frutos con los
síntomas típicos de la enfermedad.

Colección de muestras
• El muestreo se realizó en diferentes fincas de municipios
del eje cafetero, conocidos por su producción de mora de
castilla.
• El material colectado incluyó plantas de mora con y sin
aguijón, las muestras fueron marcadas y preservadas en
nevera.
Municipios con sus respectivas veredas, en donde
se colectaron plantas afectadas por antracnosis.
• En el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad
de Ciencias Ambientales de la UTP, se hicieron cortes de
las manchas oscuras que indican la presencia del hongo,
así como de los aguijones afectados.
• Estos fueron puestos en etanol al 70 % durante un minuto
y lavados con agua destilada estéril, los aislamientos se
obtuvieron por siembra directa en medio Papa Dextrosa
Agar (PDA), acidificado con ácido láctico.

Aislamiento del hongo

• En caja de petri fueron sembradas cinco partes de
material vegetal infectado, puestas en incubadora a 23 ºC.

Aislamientos de Colletotrichum sp provenientes de

cultivos de mora, cultivados en medio PDA
• Posteriormente, para obtener cultivos monospóricos, con
un sacabocados se tomaron esporas del aislamiento puro
y se sembraron por agotamiento en tubos de ensayo con
medio PDA.
Los tubos fueron
puestos en incubadora
a 23ºC en completa
oscuridad.

Crecimiento del hongo por agotamiento

• Se preparó una suspensión de esporas agregando agua
destilada estéril a las cajas petri para resuspender las
esporas, posteriormente es filtrado en gasa para evitar el
paso de micelio y de medio.

Pruebas de
patogenicidad
• Para la inoculación se utilizaron estacas de 15 cm., hojas
y frutos de plantas de mora sanos con y sin aguijón, se
realizaron tres repeticiones por tratamiento, los
tratamientos efectuaros fueron:

A. Punción de estacas:
Mediante aguja hipodérmica,
se realizaron ocho punciones,
seguidamente se asperjó con
la suspensión del hongo.

Método de punción de estacas

A. -
B. Método de herida: Se realizó un corte con bisturí, allí
fueron puestos fragmento de medio PDA con hongo,
finalmente fueron sellados con papel vinilpel.
C. Punción en hojas: Se realizaron ocho punciones a los
tres foliolos igual que a las estacas ya descritas
anteriormente.
D. Aspersión en fruto.
• Para la evaluación de las pruebas de patogenicidad, se realizó
una escala con el grado de lesión presentada (manchas de
coloración café) así:
0 Sin síntomas.
1 Síntomas leves.
2 Varias lesiones (Coalescencia).
3 Deterioro total (Muerte de tejidos).

• Las evaluaciones para todas las pruebas se realizaron cada

dos días durante 15 días.
• La caracterización de la diversidad genética de los
aislamientos de Colletotrichum se realizó siguiendo la
metodología descrita por: (Freeman y col, 1996.; Alvarez
y col, 2002.; Oliveira y col, 2005).

Caracterización de los aislamientos con

marcadores ITS (Internal Transcribed
Spacers)
• Finalmente se hizó un análisis con enzimas de restricción
(PCR-RFLP) (Alvarez y col, 2006.; Sreenivasapradsad y
col, 1996.; White y col, 1990.; Freeman y col, 1996.), la
visualización de los fragmentos se realizó en geles de
agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio.

Caracterización de Cepas
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
• Se obtuvieron 14 aislamientos de diferentes sitios del eje
cafetero, luego de 72 horas de incubación se observa el
inicio de crecimiento del hongo, al cabo de ocho días se
observó un completo crecimiento del hongo,
identificándose sus estructuras reproductivas.

Aislamiento y cultivo del hongo, y

caracterización morfológica
• Se identificaron dos tipos de crecimiento del hongo,
crecimiento rápido y micelio gris con relieve ondulado y
crecimiento lento con micelio blanco grisáceo, abundante
y esponjoso.
• La primera evaluación realizada a los dos días (48 H) de
la inoculación no muestra síntomas ni signos de la
enfermedad en los tejidos analizados.
• Al cabo de cuatro días (96 H), se empiezan a notar los
primeros síntomas de enfermedad, como lesiones
necróticas en todos los ensayos realizados, con los
diferentes tipos de tejido, como tallos, hojas y frutos.

Pruebas de atogenicidad
• En los ensayos realizados en pruebas de laboratorio
utilizando frutos, hay abundante presencia del hongo, con
abundante esporulación a los cuatro días (96 H).
• En este trabajo se realizó la extracción de ADN de los
aislamientos de Colletotrichum spp obtenidos en cultivos
de mora de la región, se evaluó la calidad y concentración
del ADN de cada una de las muestras, se obtuvo ADN de
buena calidad y en concentración suficiente para la
evaluación con los ITS.

Caracterización de los aislamientos con

marcadores ITS (Internal Transcribed
Spacers)
• La evaluación molecular aportará información muy
valiosa sobre la variabilidad genética del hongo en la
región cafetera, para lo cual la colecta de los aislamientos
del hongo se realizó tomando datos geo-referenciados.
• se encontró un grupo de secuencias de genes putativos
-1304- estos EST (secuencias de genes expresados) han
sido desarrollados y las transcripciones identificadas para
aspectos fisiológico y de interés económico.
• Los análisis de homología de las secuencias indicaron
que un 89.5% son compartidas con proteínas funcionales
y conocidas en otras especies de Rosaceae.
• Los EST son fragmentos de ADNc que se obtienen de
secuenciar la expresión de un gen, o una cadena de RNA
mensajero.
• Tanto los resultados anteriores, sobre la presencia de
genes de resistencia en fresa, como la existencia de un
grupo de EST en Fragaria; son de gran valor para que a
muy corto plazo, nuestro grupo incursione en la
evaluación de los EST relacionados con la resistencia a la
antracnosis en el germoplasma de mora.
• Se están efectuando pruebas de patogenicidad a nivel de
laboratorio, logrando estandarizar el método de
inoculación en diferentes porciones de la planta en
cámara húmeda, obteniendo el tiempo de aparición del
hongo en los diferentes inoculados.
• Se realizó la extracción de ADN, de los aislamientos en
cultivo, se observó su buena calidad y concentración, se
han realizado evaluaciones preliminares con los ITS, y se
ha obtenido amplificación positiva.

CONCLUSIONES
• Desde el punto de vista de la aplicación práctica de
nuestros resultados y su transferencia a los agricultores se
puede concluir, de manera preliminar, que antes de cuatro
días de iniciado el proceso infectivo es preciso hacer un
control de la enfermedad en campo.
• Dicho control puede contemplar la aplicación de un
fungicida sistémico y la realización de podas y
destrucción de ramas y tallos que se encuentren
afectados, buena aireación con la poda de ramas
improductivas y las ramas que ya estén fructificadas.

CONCLUSIONES