Digestión de ADN usando Enzimas de
Restricción
Dr. Jesús Lee-Borges
Dra. Liza Jiménez
Dr. José M. Planas
Dr, Jose A. Carde-Serrano
Universidad de Puerto Rico - Aguadilla
Objetivos
Repasar conceptos basicos de enzimologia
Conocer sobre enzimas de restriccion
Usar enzimas de restricción para cortar el ADN.
Electroforesis.
Separar los fragmentos usando electroforésis.
Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes
enzimas de restricción.
Enzimologia
Enzimas:
E + S -> [ES] -> P + E
Energia de Activacion
Restriccion
Enzimologia
Enzimas:
E + S -> [ES] -> P + E
Energia de Activacion
Restriccion
Historia
1968 – Descubiertas por
Werner Arber
1969 – Enzimas de
restricción tipo II
identificadas por Hamilton
O. Smith. Daniel Nathans,
ayudo avanzar la técnica de
recombinación del ADN
(primer mapa genético
usando enzimas de
restricción).
Premio Nobel en
Fisiología/Medicina 1978.
Enzimas de Restricción
Diferentes tipos
– Tipo I – Reconoce secuencias especificas y cortan el DNA
en sitios no específicos > de 1,000 pb
– Tipo II – Reconoce secuencias palindrómicas y cortan
dentro de la secuencia
– Tipo III – Reconocen secuencias especificas de 5-7 pb y
cortan de 24-27 pb “down stream” del sitio
Las enzimas de restricción Tipo II son las mas utilizadas en la
biotecnología ya que reconocen y cortan dentro de las
secuencias especificas
Enzimas de restricción
También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a
partir de una secuencia que reconocen.(exonucleasas?)
La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que
se lee igual en ambas direcciones).
Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa
para degradar material genético extraño que entre en la célula.
Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII, EcoRI, y Kpn I
toman el nombre de las bacterias que la producen:
– EcoRI: E = género Escherichia.
co = especie coli
R = cepa RV 13
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
Enzimas de Restriccion
•Llamadas enzimas de restricción porque restringen la
actividad de bacteriófagos
•“Sistema inmunológico” de las bacterias
•Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la
bacteria y lo metila
•enzimas de restricción solo atacan secuencias no metiladas
(“restriction/modification systems”)
Enzimas de Restricción
• Se han identificado cientos
de enzimas de restricción.
• Mayoría reconocen
secuencias palindrómicas
• Pueden producir cortes
abruptos o pegajosos.
Las enzimas de restricción al cortar DNA
pueden producir dos tipos de cortes:
Cohesivos o pegajosos: cortan a manera
escalonada en dos puntos diferentes.
Abruptos o truncados: cortan en un sólo punto.
Corte cohesivo con EcoRI:
Algunas enzimas de restricción
Eco RI 5'-G | AATTC
Eco RV 5'-GAT | ATC
Hin D III 5'-A | AGCTT
Sac I 5'-GAGCT | C
Sma I 5'-CCC | GGG
Xma I 5'-C | CCGGG
Bam HI I 5'-G | GATCC
Pst I I 5'-CTGCA | G
Bases Teóricas de enzimas de
restricción
La actividad de las enzimas de restricción depende
de unas condiciones precisas :
pH
Temperatura
Concentración de sal
Iones
Una unidad enzimática (u) se define como la
cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug
de DNA bajo condiciones optimas:
3-5 u/ug de ADN genómico
1 u/ug de ADN plasmico
Reacción enzimática
Buffer
(10X) 2 μL
DNA (1 μg) 1 μL
Enzimas 2 unidades
H2O _________
20 μL Volumen total
Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I,
ELECTROFORESIS DE GELATINA
¿Qué es la electroforesis de
gelatina?
Es un proceso para separar una mezcla de
moléculas a través de un material estacionario
(“gel”) en un campo eléctrico.
Historia
1933 - la técnica fue introducida por Tiselius
1959 - el “gel” policridamida fue introducido
por Raymond y Weintraub
1975 - la electroforesis de dos dimensiones
fue anunciada por P. H. O’Farrell
Geles comúnmente usados:
Agarosa: polisacárido extraído de algas.
– No tóxico.
– Poco poder de resolución pero alto grado de separación.
– Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.
Poliacrilamida: polímero de acrilamida.
– Tóxico.
– Menor grado de separación pero alto poder de resolución.
– Usado para fragmentos de DNA de 500 pb.
– Usado para separar mezclas de proteínas.
Marcadores de Peso Molecular
Son usualmente una mezcla de ADN con
pesos moleculares conocidos.
Son usados para estimar los tamaños de los
fragmentos de ADN en una muestra de ADN.
Sistema de Amortiguadores
TBE vs TAE
– TBE: DNA < 1kb
Mejor resolucion
Alta capacidad de amortiguador
– TAE: DNA > 12 kb
Menor capacidad amortiguador
Para DNA q se va a recobrar
Continúa.
Discontinúa.
Preparación del “gel” Agarosa
Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)
Tiene que pesarse y
ser mezclada con el
disolvente
– Gel agarosa 1%
1.0g agarosa
99.0 ml 1X TAE
Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)
Como la agarosa no
es soluble con el
amortiguador a
temperatura
ambiente tiene que
ser hervida.
Preparación de gel:
La mezcla de agarosa y
buffer tiene que
ponerse a calentar,
agitando
frecuentemente hasta
que llegue al punto
donde comience a
hervir.
Preparación de gel:
Una vez que el frasco
con la agarosa ya
pueda tocarse sin
quemarse, servir con
cuidado la mezcla en la
bandeja.
Dejar que se torne
opaco y sólido.
Aparato del “gel”
Consiste de:
bandeja
soporte
peineta
Aparato de “gel” (Cont.)
Colocación del “gel”
a la bandeja.
Aparato de “gel” (Cont.)
Eltanque es llenado
con amortiguador.
– 1X TAE
Aparato de “gel” (Cont.)
Cuando el gel solidifique
y se torne opaco, sacar
la peinilla y poner gel en
cámara de electroforésis
con fosas del lado del
polo negativo.
Proceder a pipetear las
muestras en las fosas.
Correr gel.
Teñir.
Práctica de uso de micropipetas:
Apoye brazo que esté
agarrando micropipeta en
superficie firme.
Utilice la mano contraria para
apoyar la micropipeta
Introduzca punta de
micropipeta dentro de fosa, sin
tocar el gel
Vierta el contenido en fosa,
presionando botón de la
pipeta hasta primer punto de
resistencia
Aparato de “gel” (Cont.)
El“gel” agarosa es
cargado con
muestras de ADN.
Organización del gel cargado con
λ ADN/Enzimas de restricción
Marcador λ DNA/Eco RI A B C D E F
λ DNA/KPN I
λ DNA/ECO RI
λ DNA/HIN DIII
λ DNA/BAM HI
λ DNA uncut
Marcador
Aparato de “gel” (Cont.)
Campo eléctrico.
– 100 V
– 30-45 minutos
Aparato de “gel” (Cont.)
Distancia migratoria.
Aparato de “gel” (Cont.)
El “gel”es colocado
en un
transluminador con
luz UV.
Aparato de “gel” (Cont.)
Partículas de ADN.
Cortar las bandas
– Guardar en
microtubos
rotular
¿Preguntas?
Preguntas
¿Cual es la función de las sales en la
eficiencia de las enzimas de restricción?
¿Por que las enzimas de restricción no
atacan el ADN de las bacterias que lo
poseen?
