UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE
GROHMANN-TACNA
FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA A.P. DE INGENIERIA METALURGICA
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
CAPÍTULO VI
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO
Profesor: Ing. Julián Nieto Quispe
2019
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL MICROSCOPIO
ELECTRÓNICO
CONTENIDO
1) Introducción
2) Preparación de muestras para el microscopio electrónico de
transmisión
3) Preparación de muestras para el microscopio electrónico de barrido
INTRODUCCIÓN
Dada las peculiaridades de trabajo en la microscopía electrónica,
sobre todo por trabajar en vacío, hay que tener en cuenta que
cualquier muestra independientemente de su naturaleza u origen
deben estar completamente deshidratas y desecadas. La
visualización de muestras mal deshidratadas o desecadas será muy
deficiente o prácticamente imposible, excepto en (ESEM), que sí
permite la visualización de este tipo de muestra
INTRODUCCIÓN
El principal requisito de una muestra para ser observada en un
Microscopio Electrónico de Barrido es que sea conductora, de no
ser así ésta se carga y como consecuencia de esto se presentan
efectos como:
1. Distorsión de la imagen debido al sobre-brillo; deflexión del
haz de electrones y astigmatismo.
2. Daño térmico de la muestra.
Las muestras inertes metálicas que conducen bien la electricidad
se pueden observar directamente al SEM, pero el resto han de
ser metalizadas (cubiertas de un metal conductor).
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL MICROSCOPIO DE
TRANSMISIÓN
Como la imagen que se forma en el TEM depende de que los
electrones puedan atravesar la muestra, ésta ha de ser
suficientemente delgada para permitirlo. Todas las técnicas de
preparación de muestras inorgánicas como biológicas, persiguen el
objetivo de adelgazar o conseguir secciones muy finas del espécimen,
menores a 100 nm, afectando al mínimo su estructura original.
Preparación de muestras biológicas para el TEM
En general, la preparación de estas muestras siempre sigue el mismo
protocolo básico:
• Fijación química,
• Lavado,
• Deshidratación en series de concentraciones crecientes de alcohol o
acetona, inclusión en resina y polimerización.
• Se incluye una etapa de tinción con metales pesados, tales como el
osmio, el wolframio o el uranio.
• La siguiente etapa consiste en obtener cortes muy finos del material
polimerizado. Para ello se utiliza un ultramicrótomo.
Preparación de muestras de materiales en polvo para el TEM
En la preparación de este tipo de muestras sólo hay que diluir una
cantidad muy pequeña de muestra en un disolvente orgánico que
no la afecte, habitualmente dicloroetano o acetona. También se
puede utilizar agua si no hay alternativa.
A continuación se busca la máxima dispersión sumergiendo la
solución en un baño de ultrasonidos y, al cabo de un tiempo, ya se
puede depositar una gota sobre una rejilla filmada con carbono para
ser observada directamente una vez se haya secado.
Preparación de muestras materiales compactas para el TEM
Para este tipo de muestras se sigue un proceso de adelgazamiento en el que es
necesaria la utilización de varios aparatos.
• En primer lugar el usuario ha de aportar una muestra que no supere las 200 µm. de
grosor.
• A continuación, el primer paso es cortar un disco de 3 mm de diámetro con el
“Ultrasonic Disk Cutter” pues este es el tamaño de la muestra que se puede introducir
en el TEM.
• El siguiente paso es excavar el disco por ambas caras hasta obtener una zona central
de unas 20 µm. con el “Dimpling Grinder”. Una vez conseguido, se introduce este disco
en el “Ion Milling” para que sea atacado por ambos lados con sendos haces de iones
de argón hasta que estos realizan un pequeño orificio central, alrededor del cual queda
una zona suficientemente delgada.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL MICROSCOPIO DE
BARRIDO
Las muestras destinadas al SEM han de cumplir dos condiciones:
• Deben estar secas y
• Ser conductoras.
El proceso de secado ha de llevarse a cabo preservando al máximo
la estructura original de la muestra. Para ello tenemos dos
alternativas:
Usar el método clásico de fijación y deshidratación química y que
finaliza con el secado por punto crítico, o
Utilizar el moderno método de fijación física por criofijación que
ya está acoplado en los microscopios.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL MICROSCOPIO DE
BARRIDO
En ambos casos la muestra necesita recubrirse después con un
material que la haga conductora y permita su observación en el
microscopio
1) Recubrimiento de muestras en bajo vacío
Con este método se realizan dos tipos de recubrimientos: “sputtering” de oro para obtener las
mejores condiciones de imagen y, si se requiere microanálisis por rayos X, el recubrimiento por hilo
de carbono.
2) Recubrimiento de muestras en alto vacío
Sus aplicaciones van más allá de la necesidad de obtener una muestra conductora para el SEM.
Consigue recubrimientos de grano mucho más fino y está preparado para realizar “spputtering” con
distintos metales. También trabaja por el método de evaporación, con lo que aumenta el rango de
posibles elementos de recubrimiento. Utiliza electrodos de carbono para evaporarlo y obtener “films”
que recubren la muestra.
Observación de muestras criofijadas
El microscopio electrónico de barrido (SEM) puede dotarse de un sistema capaz de
observar la muestra a muy baja temperatura de forma que su preservación
estructural es máxima y la capacidad de trabajo del microscopio no se afecta en
absoluto, pues ya no tratamos con una muestra hidratada sino congelada.
El proceso se inicia fuera del microscopio:
Enfriando la muestra a la máxima velocidad posible mediante nitrógeno nieve.
A continuación, ya pasa al sistema de criobservación, donde se puede fracturar,
sublimar el hielo superficial y recubrir con oro o carbono para su observación y/o
análisis.
La ventaja de este sistema es que se puede observar cualquier muestra
biológica o hidratada con una preparación mínima y rápida con una buena
preservación estructural.
Montaje
La muestra una vez desecada se ha de montar sobre
un pedestal metálico provisto de cinta adhesiva
conductora de doble capa, que sujeta firmemente a
ésta
Metalización
La metalización consiste en cubrir la muestra con un metal
conductor como el Au, el Pd o el Pt, y se realiza en vacío en
un metalizador. Cuando la muestra se va a analizar con
difracción de rayos X se suele cubrir con polvo de carbón.
Esquema del proceso de
metalización, la cámara de
metalización se encuentra rellena de
un gas inerte (Ar) y está provista de
dos placas polarizadas enfrentadas,
un ánodo donde se encuentra la
muestra a metalizar y un cátodo
donde se encuentra la placa del
metal (Au, Pd o Pt) que desprenderá
los átomos de recubrimiento.
