GENÉTICA DEL SÍNDROME LETAL
OVERO BLANCO EN EQUINOS
CARLOS ARTURO SÁNCHEZ ISAZA
M. V. MSc. Producción Animal
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y DE ZOOTECNIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
2006
A dinucleotide mutation in the endothelin-B receptor
gene is associate with lethal foal syndrome (LWFS); a
horse variant of Hirschsprung disease (HSCR).
Yang et al., Human Molecular Genetics 1998 vol 7 No 6 : 1047-1052
Enfermedad de Hirschsprung es un desorden
congénito en humanos caracterizado por ausencia
de células ganglionares entéricas en el extremo
distal del tracto gastrointestinal.
Diversos estudios en pacientes con HSCR han
demostrado mutaciones de perdida de función en
varios genes:
RET factor neurotrófico derivado de la glia (GDNF).
Receptor de Endotelina-B (EDNRB).
Endotelina 3 (EDN3).
Factor de transcripción SOX10.
Aganglionosis se presenta en roedores,
gatos, cerdos y caballos
Los roedores también tienen un patrón
característico de color de la capa,
esto sugiere que el defecto genético
reside en un mecanismo común
involucrado en la regulación del desarrollo
de dos líneas celulares derivadas de la
cresta neural: el sistema nervioso
entérico y melanocitos epidérmicos.
Aganglionosis en roedores
Cuando se producen deleción del gen RET
o ratones ”knocked out” para los genes
EDNRB o EDN3, los ratones producidos
tienen aganglionosis y cambios en el color
resultante de la capa.
Una deleción de 301 pb en el exon-intron1
del gen EDNRB produce un patrón
manchado letal en ratas, con
aganglionosis y capa blanca.
Síndrome Letal Overo Blanco
La combinación de color blanco de la capa
y aganglionosis extensa del intestino ha
sido descrita en la anomalía congénita
denominada Síndrome Letal del potro
blanco (LWFS), los cuales presentan una
obstrucción intestinal neonatal fatal.
LWFS resulta más comúnmente del
apareamiento de caballos overo x overo.
Hallazgos clínicos, histológicos y fenotipo
de la capa similares hacen sospechar que
un defecto en el gen EDNRB pueda causar
el LWFS.
Síndrome Letal Overo Blanco
Para decidir si un defecto en el gen EDNRB
produce el LWFS aislaron e identificaron el
cDNA para EDNRB en caballos de raza
standard,
Cuando compararon esta secuencia con la de
los caballos con Síndrome Letal Overo Blanco
encontraron una mutación dinucleotida de TC
a AG en el gen EDNRB en caballos con LWFS,
cambiando un aminoácido isoleucina a lisina
en la proteína de EDNRB.
Materiales y métodos
Preparación de DNA y RNA
DNA fue extraído de linfocitos de sangre periférica.
RNA fue preparada a partir de tejido del hígado
equino usando un reactivo TR1 (Molecular Research Centre).
Aislamiento de cDNA de longitud
completa para el gen EDNRB de caballo
cDNA fue sintetizado por transcripción reversa
usando primer aleatorios y transcriptasa reversa
de virus de mieloblastosis aviar (AMV) (Boering Mannheim).
Materiales y métodos
Aislamiento de la parte central de cDNA dos
segmentos fueron aislados por PCR usando dos
pares de primers (ho1/pr4 y pr3/ho2) tabla 1.
Las secuencias para los primers pr3 ypr4 fueron
idénticas a secuencias del gen EDNRB altamente
conservadas en varias especies.
Los primers degenerados ho1 yho2 fueron
diseñados para aproximarse a secuencias
encontradas en varias especies en los extremos 5
´ y 3´ del gen.
Los dos fragmentos de cDNA fueron clonados en
plasmidos y secuenciados por secuenciación
automática.
Tabla 1. Primers PCR usados en el aislamiento de cDNA de
longitud completa para el gen EDNRB en caballo
5' primer 5 ' -TGCTGCGAGAAGACGACAGAAT-3 '
her1 5 ' -GCGTTCCAGGGAAGAAAG-3 '
ho1 5 ' -CGGACGCGCCC/TTGGTT/GGCGCTG3 '
h1 5 ' -CGCCGTCCTCCCTGCTTT-3 '
h10 5 ' -GTCCTGCCTAGTGTTCGTG-3 '
h3 5 ' -CACGAACACTAGGCAGGACAC-3 '
pr3 5 ' -TATCGAGCTGTTGCTTCTTG-3 '
pr4 5 ' -CTGCATGAAGGCTGTTTTCT-3 '
hm1 5 ' -ACAAGAATGCTAAGGATTGG-3 '
h2 5 ' -ACAGTCCTTGGAAGACAAGC-3 '
ho2 5 ' -GGAACGGAAGTTGTCATATCCGTG-3 '
her2 5 ' -GGCTTTCACAATGAGGCTT-3 '
3 ' primer 5 ' -oligo(dt)30N-1N-3 '
Materiales y métodos
Se realizó PCR inversa para aislar el cDNA 5´
La primera hebra de cDNa fue hecha por
transcripción reversa usando primers oligo(dT)
dirigido al extremo 5´por oligonucleotido provisto
en un kit Capfinger PCR (Clontech).
A partir de esta primera hebra de cDNA, el primer
5´ y el primer h3 fueron usados para amplificar
las secuencias en el extremo 5´.
50 ul del producto de PCR fueron colocados
en DNA Polimerasa T4 a 16ºC por 30´ y
calentados a 72 ºC por 10´.
Materiales y métodos
Los fragmentos de DNA fueron recobrados con
precipitación en etanol y sometidos a una reacción
kinasa polinucleótido T4 a 37ºC por 30´.
Después de tratamiento con fenol cloroformo el
DNA fosforilado fue recobrado por precipitación en
etanol y autoligado con ligasa de DNA T4 para
producir moléculas circulares.
Un par de primers h1/h10 fueron usados en la
subsiguiente PCR inversa con esta molécula circular
como molde. Finalmente se obtuvo solo una banda
de DNA para clonar y secuenciar.
Materiales y métodos
Para aislar el extremo 3´del cDNA se realizó
una PCR con primer 3´y primer hm1 a partir
de la primera hebra de cDNA oligo(dT),
seguida por una PCR anidada con primer 3´y
primer h2.
La banda de DNA fue localizada sobre un gel
de agarosa de baja temperatura de
anillamiento al 2%, cortado, reamplificado y
clonado para determinar la secuencia.
Materiales y métodos
Para aislar moléculas completas de cDNA de
EDNRB, se generaron un par de primers her1
y her2 de las regiones 5´y 3´ no traducidas.
El cDNA de longitud completa fue clonado en
un vector y secuenciado automáticamente.
La secuencia del cDNA fue depositada en el
GenBank bajo la accesión No. AF019072.
Materiales y métodos
Investigación de las bases de datos y análisis
por computador.
La investigación de las secuencias en bases de
datos y el análisis de homologías se ejecuto
empleando los programas Entrez y Blast (NCBI).
El programa GCG Pileup fue usado para
alineamiento de secuencia múltiple y el dendograma
fue desplegado usando la utilidad figura del GCG.
La base de datos PROSITE fue seleccionada para
análisis de la secuencia basado en patrones
([Link]
Materiales y métodos
PCR alelo-específica y aproximación por
sitio de restricción de amplificación-
creada (ACRS)
En la PCR alelo-específica se diseñaron
primer alelo mutante:
hm4 (5´gttcgtgctgggcatcatc3´) o
primer alelo tipo silvestre:
hs1 (5´gttcgtgctgggcatcatag3´) con la mutación
dinucleótida y la correspondiente secuencia normal
localizadas en el extremo 3´ del primer.
Materiales y métodos
Los primers ACRS:
ps2 (5´agtgttcgtgctgggcatc3´) y
Ps4 (5´agtgttcgtgctgggcatga3´)
fueron diseñados conteniendo un nucleótido
mal apareado con la secuencia normal en el
extremo 3´del primer para crear un sitio BfaI
próximo a la secuencia de mutación AG y un
sitio Sau3AI sobre la secuencia próxima a la
secuencia normal respectivamente.
Materiales y métodos
La amplificación del DNA fue realizada por PCR
anidado usando primers ACRS con el fragmento
ho11/hex como molde.
La reacción de PCR fue: 3´a 94ºC, 30 ciclos de
94ºC por 40”, 63ºC para el primer ps2/hex1 (5
´cttgtagacattgatggggat3´) o 61ºC para el
primer ps4/ps5 (5´tcaagatattagggccgttcc3´)
por 40” y 72ºC por 40” . Extensión de 8´a 72ºC
Materiales y métodos
25ul del producto de DNA fueron purificados
con precipitación en etanol.
El DNA recuperado fue incubado con BfaI o
Sau3AI (Biolabs, New England) a 37ºC durante la noche.
El DNA digerido fue separado sobre un gel de
poliacrilamida 8% por electroforesis en buffer
TBE.
Resultados
Resultados
Secuencia completa del cDNA para el gen
EDNRB del caballo
La secuencia completa del CDNA esta
compuesta por un marco de lectura
abierta de 1329 pb los cuales codofican
para un péptido de 443 aminoácidos.
La comparación de las secuencias del
caballo con otras especies reveló que
comparten un 91% homología con el gen
ENDRB del bovino, 89% con humano y
85% con rata y ratón.
Dendograma de alineamiento de secuencia múltiple
mostrando la homología de la secuencia de aminoácidos
del gen EDNRB del caballo con otras especies
Resultados
Mutación TC a AG en cDNA del gen
ENDRB de caballos con LWFS
Se reveló una mutación dinucleotido TC a AG
en la posición 353-554 en LWFS la cual cambia
isoleucina a lisina en el primer dominio
transmembrana de la Proteína EDNRB.
Ni esta mutación ni la secuencia de DNA control
resultaron en un sitio de digestión por enzimas
restricción que pudiera ser utilizado para
genotipificación.
(a) The dinucleotide mutation detection by automatic [Link] sequence was determined from two
representative clones harbouring the normal and LWFS alleles, respectively.
The dinucleotide TC"AG mutation is indicated by the arrow.
Resultados
PCR alelo especifica
Cuando el primer especifico de alelo mutante
hm4 fue usado se produjo una banda de
152pb en seis caballos LWFS y ningún
producto en caballos normales.
Cuando el primer de alelo tipo silvestre hs1
se uso solo los caballos normales produjeron
bandas de 152 pb.
Esto indicó que los caballos LWFS son
homocigotos para la mutación.
Resultados
Asociación de la mutación en el gen
ENDRB con caballos LWFS
Todas las bandas de 155pb amplificadas por el
primer ps2/hex1 de caballos LWFS fueron
cortadas con BfaI en dos fragmentos de 136 y
19pb. En los caballos normales no corto.
Las bandas de 90 pb producidas con primers
ps4/ps5 no fueron cortadas con Sau3AI en
caballos LWFS pero si se cortaron en dos
fragmentos de 70 y 20 pb en los caballos
normales
(b) Association of the dinucleotide mutation with LWFS. Analysis was performed by use of the ACRS approach.
An 8%polyacylamide gel electrophoresis showing the restriction enzyme BfaIdigestion pattern of PCR products from 10
LWFS horses (M1–M10) and ninenormal horses (N1–N9) by using designed primer ps2 and hex1 primer (top).
There are indigestible 155 bp DNA bands (normal controls) and digested 136 bp bands (LWFS).
On the bottom is the Sau3AI digestion pattern of the PCR products primed with ps4 and ps5. The indigestible 90 bp
DNA band occurs only in LWFS, whereas the digested 70 bp DNA band occurs only in normal controls.
Resultados
Para ver como se hereda la mutación
dinucleotida de padres a potros afectados se
hizo un análisis familiar por PCR usando
primers ACRS en 8 familias con 22 caballos.
Todos los reproductores y madres de caballos
LWFS fueron heterocigotos para la mutación.
(a) Dinucleotide mutation in eight horse families with LWFS progeny. ACRS primer pairs ps2/hex1
and ps4/ps5 gave a PCR product from all the members of the eight horse families which were then
digested with BfaI or Sau3AI and analysed by electrophoresis on an 8% polyacylamide gel. Digested
and undigested DNAbands are indicated by arrows (the third DNA band, seen at the top, is the result
of heteroduplex DNA from heterozygotes, produced in the PCR reaction primed with ps2/hex1). The
eight horses with LWFS are numbered 1–8. The digestion pattern is directly under each notated
animal. The parents from which we could not get a sample are designated by the hatched N.
Resultados
Para confirmar la co-ocurrencia de la
mutación dinucleotida con el LWFS y
determinar la base genética del fenotipo
overo se analizaron 15 caballos overos por
ACRS.
Todos fueron heterocigotos para la
mutación. Esto sugiere que una dosis del
alelo mutante es responsable para el
fenotipo overo.
(b) Determination of heterozygosity of the dinucleotide mutation in overo paint horses. PCR products, amplified by
using ACRS primers ps2/hex1 and ps4/hex1 from 15 overo horses, were digested with restriction enzyme BfaI and
Sau3AI and analysed by electrophoresis on an 8% polyacylamide gel.
Undigested and digested DNA bands are indicated by upper and lower arrows respectively.
Resultados
