Introducción a la
cromatografía
de líquidos de alto
rendimento
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Técnicas de separación
• CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC):
En este caso, la fase móvil es un líquido, en un principio, la técnica se denominó
cromatografía de líquidos de alta presión. Este nombre distinguía esta técnica de la
cromatografía de líquidos de baja presión, que utiliza un reparto de disolvente mediante
alimentación por gravedad o bomba peristáltica. La HPLC es, en gran medida, una
técnica complementaria y se puede utilizar con éxito para la separación de una amplia
gama de compuestos.
• LA CROMATOGRAFÍA DE GASES(GC).
En el caso En la GC, la fase móvil es un gas, la GC es una técnica consolidada
conocida por su facilidad de uso; Lamentablemente, tan sólo un 20%
aproximadamente de los compuestos conocidos se pueden separar mediante
cromatografía de gases.
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Diferencias entre la HPLC
y la GC
HPLC GC
• Ningún requisito de • La muestra debe ser
VOLATILIDAD DE LA volatilidad volátil
MUESTRA • La muestra debe ser
soluble en la fase móvil
• Separa los compuestos • Las muestras son
POLARIDAD DE LA polares y no polares polares y no polares
MUESTRA • PAH(hidrocarburo
aromático polo cíclico)
iones inorgánicos.
LABILIDAD TERMICA DE LA • El análisis se puede • La muestra debe resistir
MUESTRA realizar a temperatura la temperatura elevada
ambiente o por debajo del puerto de inyección
de ella y de la columna
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HPLC GC
• En teoría no existe un • Normalmente < 500
PESO MOLECULAR limite superior amu.
• En la practica, la
solubilidad es el limite.
• La muestra debe filtrarse • El disolvente debe ser
PREPARACION DE LA • La muestra debe estar volátil y normalmente
MUESTRA en el mismo disolvente con un punto de
que la fase móvil ebullición menor que los
analitos.
TAMAÑO DE MUESTRA • Tamaño de la muestra • Normalmente 1-5 ul
basada en i.d de la
comuna.
MECANISMO DE • Participan la fase • La fase móvil es solo un
SEPARACION estacionaria y la fase portador de la muestra
móvil
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Parámetros de análisis de
HPLC
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en función de diversos parámetros: fase
móvil, fase estacionaria, mecanismo de retención y forma de contacto
FASE CROMATOGRAFÍA DISPOSICIÓN FASE CROMATOGRAFÍA ABRV.
MÓVIL ESTACIONARIA
Gas De gases (GC) Columna Líquida Gas-líquido Gas- GLC
Sólida sólido GSC
Líquida Planar Superficie Sólida En capa fina TLC PC
Sobre papel
Líquida De líquidos (LC, Columna Sólida Adsorción Partición LSC
HPLC) Ligada Intercambio iónico LLC/BPC
Iónica Exclusión molecular IEC
Porosa SEC/GPC
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PRECAUCIONES A SEGUIR CON LA FASE
MOVIL (HPLC)
FILTRAR siempre
DESGASIFICAR gradientes en baja presión
TERMOSTATIZAR fases móviles con solventes de
ajo punto de ebullición
fases móviles muy viscosas
AGITACION fases móviles complejas con
solventes poco miscibles
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ESQUEMA DE UN EQUIPO
HPLC
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Principales componentes de un equipo de HPLC: (1)
reservorios; (2) bomba; (3) inyector automático con
diferentes carruseles de muestras; (4) columna
cromatográfica; (5) detectores en serie; (6) sistema de
tratamiento de datos; (7) botella para desechos.
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DESCRIPCION GENERAL DE LA
INSTRUMENTACION
Para evitar volúmenes excesivos externos a la columna, cada
componente del sistema de HPLC debería conectarse con tubos de la
longitud más corta posible. Éste es un aspecto importante para poder
realizar tareas de cromatografía de alto rendimiento. A menudo se
emplea el término "volumen muerto" para resumir todos los
volúmenes que se encuentran fuera de la columna.
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Un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento consta
de los siguientes componentes:
Bomba
Sistema de inyección
Horno de columna
Detector
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FILTRO DE DISOLVENTES
FILTRO DE ENTRADA DE DISOLVENTE:
• Aero inoxidable o cristal con porosidad de 10 micras
• Elimina las partículas del disolvente
FITROL DE PRECOLUMNA:
• Se utiliza entre el muestreador y la columna de
protección
• 2 a 0,5 micras
• elimina las partículas de la muestra y el desgaste
del muestreador
• Debe estar bien diseñado para evitar la dispersión
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DESGASIFICADOR DE VACIO
Sensor Circuito de Bomba
control de vacío
la desgasificación de la fase móvil es un primer Bomba
paso importante de cualquier análisis de HPLC. La
desgasificación elimina los gases disueltos, que Membrana
pueden provocar la formación de burbujas en las de plástico
tubular
bombas o en la celda de flujo del detector Disolvente
Contenedor de vacío
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Funciones del sistema de reparto de disolvente
El sistema de reparto de disolvente tiene tres funciones:
1.Ofrecer un flujo constante y preciso.
2.Ofrecer composiciones de fase móvil precisas.
3.Ofrecer la fuerza necesaria para empujar la
fase móvil a través de la columna bien rellena.
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Sistemas de distribución de
disolvente
Válvula de gradiente multicanal
Determina la composición de la fase móvil.
El tapón de disolvente de mayor tamaño se llena primero.
La bomba cuaternaria 1100, 1090 PV5 y 1050.
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PRINCIPIOS DE LAS BOMBAS DEL
SISTEMA DE HPLC
BOMBAS DISCONTINUAS:
• Bombas de jeringa
• Bombas de desplazamiento controladas
por gas
BOMBAS CONTINUAS:
• Bombas de membrana
• Bombas de pistones
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BOMBA DE DIAFRAGMA
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REQUERIMIENTOS DEL SISTEMA DE BOMBEO
Debe soportar presiones de hasta 6000 psi (aprox. 400 bar)
Para permitir separaciones en tiempos razonables
Debe proporcionar flujos en el rango 0.1 a 10 mL/min, con saltos de 0.1 mL/min
Control de flujo y reproducibilidad < 0.5%
Resistencia a la corrosión
Las bombas HPLC son casi exclusivamente de PISTÓN
• Un dispositivo eléctrico actúa sobre el pistón que entra en una cámara donde se halla la
fase móvil, para comprimirlo y enviarlo a presión al resto del sistema.
• El flujo deseado se mide y alcanza en función del número de emboladas por unidad de
tiempo.
• Incorporan un dispositivo electrónico de medida y control de la presión del sistema, en
el que el usuario establece un límite máximo de presión .
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SISTEMA DE BOMBEO
• ISOCRÁTICO:
La composición de la fase móvil no se modifica
durante el análisis
• GRADIENTE :
La composición de la fase móvil se modifica durante
el análisis para ir aumentando su poder elución.
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Técnicas de inyección
MUESTREADORES:
Requisitos:
Introducción reproducible del volumen de la muestra en el flujo de la fase
móvil.
Dos diseños principales:
• Muestreadores automáticos
• Muestreadores manuales
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MUESTREADORES MANUALES
Loop de muestreo
INYECTAR
VISION FRONTAL
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HORNO DE COLUMNA
Es necesario que la columna y el disolvente tengan una temperatura
constante para conseguir resultados reproducibles
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CARACTERÍSTICAS DEL
DETECTOR IDEAL:
Respuesta específica a analitos de interés
No afectado por cambios en temperatura o composición de la fase
móvil (ej. gradientes)
Alta sensibilidad (análisis de trazas)
No contribuir al ensanchamiento de bandas, volumen de celda
pequeño
Respuesta rápida
Fácil manejo, duradero y barato
Precisión
Respuesta lineal
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TIPOS DE DETECTORES
GENERALES: Responden a las propiedades de la fase móvil que
varían en presencia de solutos (índice de refracción, visco
simétricos, etc.)
ESPECÍFICOS: Responden a alguna propiedad del soluto, no
presente en la fase móvil (absorbancia UV-VIS, masas, etc.)
• ÓPTICOS:
Fotométricos:
o Absorbancia UV/VIS: longitud de onda discreta o rango
espectral continuo (PDA - fotodiodos)
o Fluorescencia
Refracto métricos, polarimétricos, evaporativos (light-
scattering).
ELÉCTRICOS: electroquímicos, conductimétricos
De técnicas acopladas: de masas, IRTF, AA, ICP.
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DISOLVENTES MÁS USADOS EN
HPLC
• Agua (grado MilliQ, tampones)
• Disolventes orgánicos:
Metanol
Acetonitrilo
Isopropanol
Diclorometano
Hexano
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CARACTERISTICAS DE LOS ELUYENTES
• Pureza
• UV cutoff
• Miscibilidad
• PH
• Estabilidad
• Propiedades físicas y toxicológicas
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Parámetro Fórmula Significado
Tiempo de retención tR Suma del tiempo que el analito permanece en la fase móvil y el
tiempo que interacciona con la fase estacionaria
Cociente del tiempo en que el analito está en interacción con la
Factor de capacidad k= fase estacionaria (tR – to) y el que permanece en la fase móvil
(to)
Selectividad (factor
de separación) Cociente del factor de capacidad de dos picos adyacentes. Es una
a= medida del potencial del sistema cromatográfico para separar dos
compuestos.
Velocidad lineal de
la fase móvil u= Se calcula dividiendo la longitud de la columna (L) entre el tiempo
que necesita la fase móvil para pasar a través de la columna (to)
Resolución La resolución de dos picos adyacentes es el cociente entre la
distancia que hay entre los máximos de ambos picos y la media
aritmética de sus anchuras respectivas (w). Determina la calidad
de la separación de dos picos
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CLASIFICACIÓN DE LOS PROCESOS
CROMATOGRÁFICOS EN HPLC
Los distintos tipos de fuerzas entre fase estacionaria y analitos definen los distintos
tipos de cromatografía HPLC
Proceso Abreviatura
cromatográfico (inglés) Tipos
Adsorción LSC (líquido-sólido) ⎯
Partición BPC (fase ligada) Fase reversa
Interacción hidrofilica
Intercambio iónico IEC Intercambio aniónico
Intercambio catiónico
Exclusión por tamaño SEC/GPC ⎯
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APLICACIONES DE LA HPLC
QUIMICA • poliestirenos
• colorantes
• ftalatos
FARMACOS • Tetraciclinas
• Antidepresivos
• Barbituratos
• Corticocteroides
MEDIO AMBIENTE • Hidrocarburos poliaromaticos
• Iones inorgánicos
• herbicidas
BIOCIENCIA • Proteina
• Peptidos
• nuclastidos
CLINICA • Aminoacidos
• Vitaminas
• Homocisteina
PRODUCTOS DE CONSUMO • Lipidos
• Antioxidantes
• azucares
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CROMATOGRAFÍA HPLC DE ADSORCIÓN
Líquido-Sólido
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CROMATOGRAFÍA HPLC DE
ADSORCIÓN
Es el método cromatográfico más
antiguo
La interacción, de tipo
electrostático, se
produce entre la parte polar del
analito y los
grupos OH de la sílice. Está
interacción compite con la que
tiene lugar entre la fase móvil y
los grupos funcionales de la sílice.
Está basada en el mismo
principio que la cromatografía en
capa fina (TLC) y la cromatografía
de columna en gel de sílice
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FASES ESTACIONARIAS:
• Sílice
• Alúmina
• Hodroxiapatito
FASES MOVILES:
• Hexano
• Isooctano
• Cloroformo
• Acetato de etilo
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COMPUESTOS QUE PUEDEN SER
SEPARADOS
• Olefinas
• Hidrocarburos aromáticos Listados en orden
• Haluros, sulfuros
creciente de
• Éteres
• Nitro-derivados
tiempo de
• Esteres,aldehídos,cetonas retención: de
• Alcoholes, aminas menor a mayor
• Sulfonas interacción con la
• Sulfoxidos fase estacionaria
• Amidas
• Ácidos carboxílicos
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CROMATOGRAFIA
HPLC DE PARTICION
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COMPARACION ADSORCION –PARTICION
COMPARACIÓN ADSORCIÓN-PARTICIÓN
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CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN EN FASE
REVERSA
FASES ESTACIONARIAS:
• Octadecil C18
• Octil C8
• Butil C4
• Fenil C6H5
FASES MOVILES:
• Acetonitrilo
• Metanol
• THF
Con agua como componente de la fase móvil
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FASE REVERSA
La fase estacionaria es menos polar que la fase
móvil
FASE ESTACIONARIA:
APOLAR
FASE MOVIL:
POLAR
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FASE REVERSA
La retención esta basada en la interaccion, de tipo
hidrófobo entre la fase estacionaria y la regio no polar del
analito.
Mas del 90% de las aplicaciones HPLC de compuestos de
bajo peso molecular se hacen en cromatografía de
partición en fase reversa.
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CONTROL DE LA RETENCION EN FASE
REVERSA
Para aumentar el tiempo de retención de
los analitos, aumentar la polaridad de la
fase móvil.
Esto suele conseguirse e incrementando el
porcentaje de agua
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Campo de aplicación Ejemplos
Farmacia Antibióticos, analgésicos, esteroides
Medio ambiente Pesticidas, Herbicidas, Fenoles, PCBs
Industria química Detergentes, Polímeros
Alimentación Edulcorantes, emulgentes, antioxidantes
Bioquímica Proteínas, Hidratos de carbono, Lípidos
Clínica y Diagnóstico Análisis de orina y sangre, Dopaje, Hormonas
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