WESTERN BLOT
Likay Nayla
Pérez Klala Victoria
Wallace Evelyn
WESTERN BLOT
TÉCNICA ANALÍTICA USADA PARA DETECTAR
PROTEÍNAS ESPECÍFICAS EN UNA MUESTRA
DETERMINADA
1. Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas de interés.
2. Son transferidas a una membrana adsorbente (nitrocelulosa) para poder
buscar la proteína con anticuerpos específicos contra ella.
3. Finalmente se detecta la unión antígeno-anticuerpo por distintos
métodos como actividad enzimática o fluorescencia.
1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Las muestras pueden ser de:
tejido entero
un cultivo celular
Se introducen en un buffer de extracción.
Se procede a homogeneizarlos o disgregarlo por medios
mecánicos: licuadora (para grandes volúmenes de muestra),
homogenizador (para muestras pequeñas) o por sonicación.
Se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante
2. ELECTROFORESIS EN GEL
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante
electroforesis en gel en función de uno o varios criterios:
punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica
La electroforesis en gel más frecuente, conocida como
SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de
tampón con dodecilsulfato (SDS).
Se produce la desnaturalización de las proteínas y de esta
forma se pueden separar en función del tamaño.
3. TRANSFERENCIA
Se transfiere a las proteínas desde el gel de
poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa, que se
caracteriza por unir proteínas de forma inespecífica.
Se puede realizar por difusión, por vacio o por acción de
un campo eléctrico (electrotransferencia).
En la electrotransferencia, se trabaja con una corriente
eléctrica y un tampón de transferencia para llevar las
proteínas desde el gel hacia la membrana.
4. BLOQUEO
Se deben bloquear los lugares de unión que quedaron
libres luego de la transferencia.
Se incuba la membrana con una solución de proteínas,
típicamente de albúmina de suero bovino (ASB), leche en
polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente.
Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos
lugares de unión de la membrana que no estén ya
ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo,
el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico,
reduciendo los falsos positivos.
5. DETECCIÓN
Se comprueba la presencia en la membrana de una
determinada proteína, para lo cual se emplea un
anticuerpo específico unido a enzima que, en presencia
de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica
(produce color).
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos
pasos, aunque ahora es posible la detección en un único
paso.
- MÉTODO DE DOS PASOS
1) Anticuerpo primario: se produce la unión contra la
proteína buscada, previa incubación de la membrana
con una solución de Ac primario.
2) Anticuerpo secundario: Tras lavar la membrana, se
expone al Ac secundario que reconoce de forma específica
una región del Ac primario. Suelen estar marcados para ser
detectables (biotina, enzima reportera, como la fosfatasa
alcalina o la peroxidasa del rá[Link]) y se procede a la
detección mediante varios mecanismos:
- Unión del Ac secundario a enzimas que catalicen la
transformación de un sustrato soluble en un producto
insoluble; quedará una mancha donde esté la proteína de
interés.
- Unión del Ac a una enzima que catalice una reacción
quimioluminiscente.
- MÉTODO EN UN PASO
Requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo
la proteína de interés y posea una "etiqueta" detectable.
Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del
proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se
puede detectar directamente.
APLICACIONES DE LA TÉCNICA
Actualmente es una de las técnicas más usadas en varios
campos de la biología, como la biología molecular,
bioquímica, inmunología y biotecnología.
DIAGNÓSTICO
Prueba de VIH: Western Blot se usa como prueba confirmatoria
cuando el ELISA da un resultado positivo.
Se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano.
Se transfieren a una membrana las proteínas de células que están infectadas
por el VIH y se incuba el suero que hay que probar con esta membrana; si
hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el papel
de anticuerpo primario.
Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a
incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-
señal. La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las
cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es
seropositivo.
Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme
bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".
