INMOVILIZACIÓN DE

ENZIMAS
Temas a tratar:

• Introducción
• Métodos de inmovilización
• Propiedades de las enzimas inmovilizadas
 Introducción

Iniciemos con una breve introducción en la que se

comparan las propiedades de las enzimas libres y las
enzimas inmovilizadas, lo cual permitirá comprender las
ventajas del uso de las enzimas inmovilizadas
Enzimas en disolución (enzimas libres) Inmovilización de enzimas

■ Excelentes métodos (selectivos ■ Proceso por el que se confina la

y sensibles) para la enzima en un soporte adecuado
determinación de sustratos, para obtener una forma
activadores, inhibidores. insoluble de la misma que retiene
su actividad catalítica
■ Las enzimas son solubles en
medio acuoso y no pueden ■ La inmovilización permite
reutilizarse
 Reutilizar la enzima
■ Estabilidad limitada.
 Aumenta la estabilidad del
■ Preparación de disoluciones preparado
debe realizarse frecuentemente

Costos menores
Costos elevados
soporte = material en el que se aloja la enzima
Aplicaciones Analíticas: Aplicaciones Ambientales:
Diseño de biosensores Remoción de contaminantes
Reactores enzimáticos en agua

Enzimas inmovilizados

Aplicaciones Médicas
Aplicaciones
Tratamiento con
Industriales
enzimas inmovilizados

Industria farmacéutica
Industria alimentaria
Industria química
Métodos de inmovilización
 Retención física Inmovilización química

Sin formación de enlaces covalentes Con formación de enlaces covalentes

Atrapamiento o
Adsorción
inclusión Unión covalente Entrecruzamiento

La enzima queda atrapada por la La enzima queda atrapada

interacción con el soporte o dentro del soporte
atrapada dentro del soporte
En general se tiene una mayor
estabilidad del sistema
Revisemos primero los métodos físicos de inmovilización
que en general son más fáciles de llevar a cabo y
producen una interacción más débil entre la enzima y el
soporte
 Inmovilización por Adsorción
Sucede por la nteracción física, no específica (puentes de hidrógeno interacciones
hidrofóbicas, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals) entre la enzima
y el soporte.
 El método más sencillo
 De aplicación general
 Costo moderado

 Estabilidad limitada, se requiere un control

Uniones
riguroso de las condiciones de trabajo para
Reversibles
evitar pérdidas de enzima por desorción.
No covalentes

Soporte: Alumina, carbón activo,

vidrio, Resinas cambiadoras
 Atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa

Formación de un polímero altamente entrecruzado

en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en
los poros de la matriz polimérica formada.

 Se requiere controlar las condiciones de

polimerización para que no se produzcan
alteraciones en la molécula enzimática

 Se puede perder proteína lentamente

Soporte: Gel de
poliacrilamida
 Se pueden obtener membranas con Polímeros
enzimas inmovilizadas conductores

 De aplicación general
 Atrapamiento por microencapsulación

Se atrapa la enzima en microcápsulas (1-

100 µm diámetro) dentro de membranas
semipermeables de polímeros que permiten
la difusión de sustratos y productos pero
no de la proteína.

 Se requieren elevadas
concentraciones de proteína Soporte: membranas
en disolución acuosa (10 mg/L) poliméricas obtenidas en un
proceso de polimerización en
una interfase orgánica-
acuosa
los métodos químicos de inmovilización que en general
son más complicados de llevar a cabo y producen una
interacción más fuerte entre la enzima y el soporte
 Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente

Formación de enlaces covalentes entre el enzima y el soporte

pero no entre las moléculas de enzima.

Se debe asegurar que el centro activo de la enzima no

se ve afectado por los reactivos empleados en el
proceso de inmovilización.

Se puede proteger el centro activo con un análogo del

sustrato o un inhibidor competitivo durante el proceso
de inmovilización.
 Métodos Químicos no polimerizantes- Unión covalente

El tipo de soporte determina la química de la inmovilización, dependiendo del

soporte son grupos funcionales de la enzima con los que puede interactuar

Soporte Enzima

Grupo funcional Soporte

-CONH2 Poliacrilamida -OH-Ph Tirosina -SH Cisteina
-COOH Carboxymetilcelulosa
-NH2 Poliestireno, nylon -COOH Aspartato -OH Serina
-OH Celulosa, agarosa, sephadex Glutamato
-NH2 Lisina
-Si(OH)3 Vidrio poroso -Nimidazol Histidina

Requiere la activación para obtener Unión a través de las cadenas

grupos funcionales reactivos laterales
de los aminoácidos de la secuencia
polipeptídica de la proteína
 Para llevar a cabo la inmovilización se deben llevar a
cabo reacciones especificas para activar el soporte y
después llevar a acabo la reacción para la unión de la
enzima al soporte

En el nivel más sencillo de trabajo, siempre partimos de

métodos establecidos, que se reproducen en el
laboratorio para lograr la inmovilización de la enzima
deseada
 Entrecruzamiento

La inmovilización sucede por la formación de enlaces

covalentes intermoleculares (entre las moléculas de
enzima) y la formación de enlaces en las enzimas y el
soporte

Ventajas

Se pueden inmovilizar cantidades altas de proteína que

es resistente a condiciones extremas de pH y temperatura

Desventajas
Las redes de moléculas entrecruzadas que se forman dificultan el
acceso del sustrato al centro activo
Ocurren pérdidas de actividad tras la inmovilización de altas
concentraciones de enzimas
 Entrecruzamiento

Reactivos bifuncionales más utilizados

N2 N2 O O
H H
ICH2 C N (CH2)6 N C CH2I
Diazobenzidina
CHO
Hexametileno-bis(iodoacetamida)
(CH2)3
CHO
O
Glutaraldehido O O O
N O C (CH2)2 S S (CH2)2 C O N

O O

Bis(N-hidroxysuccinimidyl)ditiopropionato
 Efectos de la inmovilización
en la actividad enzimática

La inmovilización confiere a las enzimas propiedades

diferentes con respecto a las enzimas libres, veamos
estos efectos
Las propiedades de las enzimas inmovilizadas, de manera más precisa de las de las
partículas catalíticas que contienen a las enzimas, dependen de la conjunción de
dos factores: i) transporte de sustrato y producto y ii) actividad catalítica de la
enzima

Si la mezcla está en reposo, el

En estos sistemas, el sustrato debe transporte se produce por difusión
ser transportado desde el seno del molecular
líquido a la superficie del
catalizador En un sistema con mezclado se
introduce contribuciones de
transporte convectivo
Con respecto al transporte se pueden presentar dos casos:

Si no existe enzima ocluida en el

sólo se está en presencia de un
interior de los poros de la partícula
fenómeno de transporte de masa
de soporte
externo.

Si la enzima está localizada en el

el fenómeno es de transporte de
interior de la partícula soporte y el
masa interno
sustrato se debe movilizar desde la
superficie al interior para que la
reacción pueda ocurrir
 enzimas inmovilizadas enzimas libres

Debido a limitaciones
a la difusión

Velocidad de reacción < la velocidad de reacción

Para estimar Vr
Se requiere conocer el perfil de [S]

se establecen gradientes entre

el seno de la mezcla (Ss) y los El efecto observado
sitios activos de la molécula de es la disminución de
enzima inmovilizada (Sr) actividad

No hay limitaciones difusionales externas

Con respecto a la actividad enzimática:

Inmovilización
La estabilidad
tiene efeto
Las propiedades cinéticas
sobre

1. Efectos en la Estabilidad

 Estabilización conformacional de Confiere mayor resistencia a

desactivación térmica o química
la enzima por uniones multipuntuales
enzima-soporte
Confiere mayor estabilidad, por
 Alteración del microentorno ejemplo en medios orgánicos
de la enzima cunado la enzima está
inmovilizada sobre soportes
hidrofílicos

Esto permite que las enzimas puedan mantener su actividad en condiciones

más extremas en las que normalmente podrían estar inactivas
Con respecto a los efectos en las propiedades cinéticas,
estos tienen que ver con cambios que ocurren
propiamente en la enzima y con cambios en el entorno
 Efectos sobre el biocatalizador
propiamente dicho Estos producen cambios en la
 Restricciones estéricas enzima provocando que su
 Cambios conformacionales velocidad se modifique

Dado que la enzima está alojada en un soporte sólido su comportamiento sería

similar al dela catálisis heterogénea, donde el comportamiento del sustrato
depende de la características del soporte que define el microambiente

 Efectos sobre el microambiente Las propiedades de solubilidad

 Efectos de partición definen la accesibilidad del
 Limitación a la difusión sustrato
 Internas
El tamaño del poro definirán la
 externas
difusión del sustrato en el
soporte
 Cinética intrínseca: la que sigue el
enzima soluble
Considerando lo
anterior se puede Cinética inherente: la que sigue un
entender que al enzima inmovilizado en ausencia de
hablar de la factores modificantes
cinética enzimática
se tienen tres Cinética efectiva: la que sigue un
niveles enzima inmovilizado en presencia de
factores modificantes

Los factores modificantes se

refieren a los cambios provocados
por el microambiente
 Lo anterior significa que para estudiar la actividad en
esos tres niveles se requiere de información diferente
 • Parámetros cinéticos de la
Cinética inherente
enzima

• Parámetros cinéticos de la
Cinética intrinseca enzima
• Información sobre la estabilidad
de la enzima y actividad

• Parámetros cinéticos de la
Cinética efectiva enzima
• Información sobre la estabilidad
de la enzima y actividad
• Información sobre los fenómenos
de difusión
La determinación de parámetros cinéticos de una enzima
libre son fáciles de determinar

La información sobre la estabilidad y actividad de la

enzima sigue procedimientos similares a los de la
determinación de la actividad enzimática

La información sobre fenómenos de difusión requiere un

amplio estudio
Con respecto a los fenómenos de difusión se requiere saber