QUIMIOLUMINISCENCIA

Dra. Liliana Fernández

 Quimioluminiscencia
Emisión de luz por una reacción
química
En una reacción química quimioluminiscente se
originan intermediarios en estado electrónicamente
excitado que emiten fotones (a temperatura
ambiente).

A + B C*
fotón
Reactivos Intermediario
electrónicamente excitado
 Quimioluminiscencia

• Alternativa simple, rápida y sencilla para

cuantificar diversos analitos.
• Aplicable a análisis cuali y cuantitativo.
• Elevada sensibilidad, adecuada
selectividad y amplio rango lineal.
• Instrumental de bajo costo.
 Quimioluminiscencia

• Comienzos:
Primeras aplicaciones (1957): luminol,
lofina y lucigenina, como indicadores
volumétricos.

• Como detección en FIA, electroforesis

capilar, cromatografía y en inmunoanálisis.

• Campos de aplicación en permanente

crecimiento: química, biomedicina,
alimentación, medioambiente y toxicología.
 Características relevantes

Quimioluminiscencia se describe como

una técnica de “ campo oscuro”.

La instrumentación para medidas de

QL varía desde sistemas muy simples
hasta instrumentación más compleja.
 Limitaciones
• Falta de selectividad.

• La emisión que varía con el tiempo.

• Perfil de emisión dependiente del

sistema.

• Se debe extremar el cuidado para

detectar la señal midiendo en
períodos de tiempo bien definidos.
Mecanismos de las reacciones
quimioluminiscentes
 Requerimientos

a) La reacción debe ser exotérmica y

producir la suficiente energía para formar
el estado electrónicamente excitado.

donde λex es la longitud de onda (en nm)

para la excitación de las especies
luminiscentes.
 Requerimientos

b) El camino de reacción debe ser

energéticamente favorable hacia la
formación de un estado
electrónicamente excitado.

Si la energía química se disipa en forma

de calor, vibraciones o rotaciones
moleculares, la reacción no será
quimioluminiscente.
 Requerimientos

c) La emisión de un fotón debe ser un

proceso favorable en relación a otros
procesos no radiantes (disociación
molecular, otras reacciones, etc.).
 Rendimiento cuántico

• La intensidad de la emisión producida depende

de la eficacia para generar moléculas en el
estado excitado, lo cual viene representado
por la eficiencia cuántica (rendimiento
cuántico) y la velocidad de la reacción.
 Factores que influyen en la
quimioluminiscencia

 La estructura química del precursor

quimioluminiscente.
 La naturaleza y concentración de otras sustancias
que afectan el proceso.
 El catalizador seleccionado.
 La presencia de iones metálicos, especialmente
metales de transición implicados en el proceso de
oxidación.
 La temperatura.
 pH y fuerza iónica.
 La hidrofobicidad del disolvente.
 La presencia de aceptores de la energía
transferida.
 Características analíticas
a) La técnica comprende simultáneamente
características cinéticas y luminiscentes, por lo que
proporciona una alta sensibilidad y un amplio rango
dinámico.

Si el redimiento cuántico es lo suficientemente alto,

se pueden alcanzar límites de detección excelentes
(femtomoles).

En comparación con otras técnicas espectrométricas,

la quimioluminiscencia es aproximadamente 105 veces
más sensible que la espectrometría de absorción y al
menos 103 veces más sensible que la fluorimetría.
 Características analíticas

b) Comparada con los procesos de

fotoluminiscencia, no se requiere fuente de
excitación externa:
 ausencia de dispersión y señales
fotoluminiscentes de fondo
 desaparición de problemas relacionados
con la inestabilidad de la fuente externa
 reducción de interferencias debidas a
procesos de excitación no selectivos
 instrumentación más simple.
 Características analíticas

c) La selectividad y la linealidad son más

dependientes de la reacción y de las
condiciones de reacción escogidas.

d) La técnica es versátil para la

determinación de una amplia variedad de
especies que pueden participar en el
proceso quimioluminiscente.
 Características analíticas
e) Dependiendo de la naturaleza del analito y
de la reacción, el incremento o disminución
de la intensidad de quimioluminiscente
estará directamente relacionada con la
concentración de analito.

f) Las reacciones quimioluminiscentes pueden

acoplarse fácilmente como método de
detección en cromatografía, EC o
inmunoensayo.
 Reacciones principales
• Acilhidracidas (Ej. Luminol)

Aplicaciones: determinación de iones metálicos

(catalizadores), enzimas (peroxidasas, compuestos
hemáticos, etc), ciertos oxidantes, inhibidores o
sustancias que son fácilmente oxidables.
 Reacciones principales
• Imidazoles (Ej. Lofina)

• Aplicaciones: determinaciones de Co(II), Cr(III),

Cu(II), Fe(CN)63-, MnO4-, ClO-, entre otros.
 Reacciones principales
• Ésteres de acridinio (Ej. Lucigenina).

• Aplicaciones: determinación de varios iones, oxidantes

o reductores como el ácido ascórbico.
 Reacciones principales
• Tris(2,2’-bipiridina) rutenio (III)
* Por reacción de Ru(bpy)33+ y Ru(bpy)3+
Ru(bpy)33+ + Ru(bpy)3+ [Ru(bpy)32+]*

*Por reacción de Ru(bpy)3+ con ciertos oxidantes

Ru(bpy)3+ + ox [Ru(bpy)32+]* + ox-

*Por reacción de Ru(bpy)33+ con ciertos

reductores
Ru(bpy)33+ + red Ru(bpy)33+ + red+
 Reacciones principales
• Peroxioxalatos

Aplicaciones: determinación de peróxido de hidrógeno,

hidrocarburos aromáticos policíclicos y compuestos no
fluorescentes, por reacción con cloruro de dansilo
(aminoácidos, esteroides, aminas alifáticas,
ácidos carboxílicos, etc.) o con fluorescamina
(catecolaminas).
Instrumentación: Luminómetro
Introducción de la muestra y reactivos

• Pueden clasificarse en:

estáticos (introducción de cantidades
discretas de reactivos y muestra en un
recipiente),
sistemas en flujo.
 Sistemas estáticos
Pequeñas porciones de muestra y reactivo se
mezclan rápidamente en la cubeta de reacción a
temperatura controlada.

El reactivo que inicia la reacción se adiciona

con una jeringa o usando un inyector automático.

La mezcla de los reactivos y la muestra se

produce por la fuerza de la inyección, aunque a
veces, se puede utilizar un agitador magnético.
 Sistemas en flujo
La muestra y los reactivos son bombeados
y mezclados a través de un conector que está
muy próximo a la detección.

La señal se observa cuando la celda está

totalmente llena con la mezcla de reacción, a
un tiempo predeterminado después de la
mezcla.

Es posible obtener una señal constante y

reproducible que representa la emisión total
de la mezcla de reacción durante el tiempo que
está en la celda.
 Sistema de inyección en flujo

 El analito se incorpora a una disolución

portadora;
 el reactivo va por una línea aparte y fluye
constantemente;
 la muestra es inyectada en la disolución
portadora y a través de conectores o válvulas para
producir la reacción quimiluminiscente.

La señal se obtiene como un pico estrecho que se

corresponde con la alícuota de analito inyectada
(fiagrama)
 Componentes de sistemas en flujo

Conectores

Bomba peristáltica

Bucle de muestra
Determinación de glucosa mediante FIA con
detección quimioluminiscente
 Detector

Requerimientos básicos
a) Capacidad de detectar una señal luminosa de
varios órdenes de magnitud de intensidad.
b) Sensible al menos en la región espectral de
400-600 nm (idealmente 380-750 nm).
c) La señal directamente proporcional en todo el
rango de sensibilidad requerido. La señal
producida por el detector debe poder ser
fácilmente leída, registrada y analizada.
d) La velocidad de respuesta del detector debe
ser más rápida que la velocidad de la reacción
Aplicaciones
Aplicaciones
Luminol + H2O2

Co2+

3-aminoftalato + 3 H2O + N2 + hv ( = 450 nm)