PCR LONG
y HOT START
Vera Ramírez Juan Carlos 5OV1
Hot start PCR
VENTAJAS Utilidad: Está recomendada para reacciones
de PCR que requieran alta especificidad
Amplicones fuera del
objetivo:
Mayor Se cree que se originan
especificidad de durante la temperatura mas
reacción. baja y pueden formar
dímeros en los cebadores
productos de extensión de
Mayor cebado incorrecto, que
rendimiento. finalmente competirán con
la amplificación del
objetivo deseado durante
Reduce el proceso de ciclado
amplificaciones térmico
fuera del objetivo.
FUNDAMENTO
La amplificación
comienza hasta la
RETENCIÓN de Bloqueo del primera etapa
(desnaturalización)
un componente a . Los anticuerpos
componente temperatura unidos se
clave. ambiente. degradan y
activan la
reacción.
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PROCESO
Resultados de una PCR estándar vs. Hot start PCR
Nótese los rendimientos mejorados del amplicón
deseado y la falta de amplificación inespecífica
con una ADN polimerasa de inicio en caliente.
Saleem, N. 2014. Proyecto aptamer PK6. Freshman research initiative (en línea). Disponible en: [Link]
polymerase-pk6-aptamer-development/nimrah-fatima-saleem-s-pk6-aptamer-project-2014
PCR de “inicio en caliente” usando iniciadores con la estructura de
señaladores moleculares (Estructura de horquilla)
Figura 1. Efecto del iniciador
en PCR estandar y “Hot start”.
(A) Objetivo AND de M.
tuberculosis con PCR
estandar; Líneas (1) Marcador
de AND (2-4) y (8-10) Iniciador
de horquilla, (5-7) y (11-13)
Iniciador estandar. (B)
Objetivo ADN de M.
tuberculosis con PCR “Hot-
start”; Lineas (1) Marcador
AND, (2-4) y (8-10) Iniciador
de horquilla, (5-7) y (11-13)
Iniciador estandar.
PCR Larga
(PCR Long)
FUNDAMENTOS
Reacciones de PCR limitadas por el tamaño máximo de los
fragmentos amplificados.
Cuando mayor es la secuencia del DNA, mayor es la probabilidad
de que haya una o varias lesiones.
Enzima: Long PCR Enzyme Mix es una mezcla única de Taq DNA
Polymerase y un DNA termoestable. Polimerasa con actividad
correctora. Las dos enzimas generan sinergísticamente una PCR
larga.
PCR LONG (Largo alcance)
• Para amplificar fragmentos
genómicos largos.
Polimerasa Exonucleasa
• La PCR de largo alcance aumenta
con eficaz con
el tamaño de la región para actividad
en la
amplificar. elongación. reparadora.
• Modificación de las polimerasas.
Aplicaciones
Clonación. Ventajas
Mapeo.
Secuenciación del genoma. Mayor sensibilidad.
Detección de daños en el DNA, Rápida.
Análisis de mutaciones. Eficiente.
Algunos factores a considerar:
Desnaturalización: 20 seg -98 °C, 30 seg -94 °C.
Concentración de Mg2+
Concentración de la enzima
PCR Larga mejora la amplificación de ADN de Wolbachia: Secuencias de
wsp encontradas en el 76% de sesenta y tres especies de artrópodos.
PCR estándar: Producía falsos negativos.
PCR long: Más sensible en la amplificación del
plásmido en el genoma de los insectos.
Figura 1. PCR larga ampificada exitosamente (A) ftsZ y (B)
secuencia wsp de 5 o 6 especies de artrópodos; Las mismas
secuencias de AND fueron negativas para Wolbachia en las
PCR aleloespecíficas estandar.
Figura 2. Analisis de sensibilidad de PCR
estándar y Larga. (A) PCR estándar +
plásmido; linea (1) Marcador ADN VI, (2)
Control (Sin ADN), (3–11) Plasmido. (B) PCR
estándar + plásmido + ADN T. radiata. (C)
PCR larga + plásmido + ADN T. radiata; línea
(1) Marcador ADN VI, (2) Control, (3) ADN
control T. radiata, (4–12) Plásmido.
Vecino mas cercano Similitud
Referencias
Cortazar A., Silva E. 2004. Métodos Físico-Químicos en Biotecnología. Disponible en línea en:
[Link]
Haiying Jia, Yunfei Guo, Weiwei Zhao Y Kai Wang. 2014. PCR de largo alcance en secuenciación
de próxima generación: comparación de seis enzimas y evaluación en el secuenciador MiSeq.
Jeyaprakash, A. and Hoy, M. A. 2000. Long PCR improves Wolbachia DNA amplification: wsp
sequences found in 76% of sixty-three arthropod species. Insect Molecular Biology. 9(4), 393–405
p.
PCR larga y precisa. Disponible en línea en: [Link]
science/molecular-biology/[Link]?TablePage=9620572
Weissensteiner, T. ,Nolan T., Bustin A., Griffin H., Griffin A. 2003. PCR Technology: Current
Innovations, Second Edition. CRC Press. 416 p.
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