CROMATOGRAFÍA

Zavaleta De la Cruz Lauriano

 HISTORIA
Mikhail tswet, Russian, 1872 – 1919
Botánico
 En 1906 usa la cromatografía
para separar pigmentos de plantas. pigmentos
separados
 El llamó a la nueva técnica
cromatografía, por que el resultado
del análisis fue visualizado en color
a lo largo de la columna del absorbente.
 Croma: Color Grafía : Escribir
 C R O M A T OG R A F Í A
 La cromatografía es un método físico de separación
en que cada uno de los componentes a ser separados
son distribuidos entre dos fases.
 Fase estacionaria
 Fase móvil.
 El proceso cromatográfico ocurre debido a las
diferencias en la constante de distribución de los
components individuales de la muestra.
CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFIA
 De acuerdo a la fase estacionaria
 Cromatografía en capa fina ( TLC): La fase
estacionaria es una delgada capa que tiene como
soporte una placa de vidrio, plástico o aluminio.
 Cromatografía en papel (PC) : La fase
estacionaria es una lámina de papel.
 Cromatografía en columna: La fase estacionaria
está empacada dentro de una coumna de vidrio.
 De acuerdo a la fase móvil
 Cromatografía líquida: La fase móvil es un líquido
(LLC, LSC).
 Cromatografia de gases: La fase móvil es un gas
( GSC, GLC ).
 De acuerdo a la fuerza de separación
 Cromatografía de adsorción
 Cromatografía de partición
 Cromatografía de intercambio iónico
 Cromatografia de filtración en gel
 Cromatografía de afinidad.
Cromatografía en capa fina
 Es un método para identificar sustancias y determiner
la puereza de components.
 Es una técnica eficáz por que es relativamente rápida
y requiere pequeñas cantidades de material.
 Implica a distribución de dos o mas sustancias entre
una fase estaconaria y una fase móvil.
 Fase estacionaria : Delgada capa de adsorbente,
usualmente silica gel o alumina, adherida sobre una
placa.
 Fase Móvil : Es un líquido que recorre la fase
estacionaria, transportando la muestra.
 Los components de la muestra serán
separados de acuerdo como se adsorben
sobre la fase estaconaria o se disuelven en la
fase móvil
Incremento del tiempo de desarrollo
 Distancia del inicio del centro de la mancha del componente
Rf = -------------------------------------------------------------------------------
Distancia del inicio del frente del solvente
Cromatografía en capa fina preparativa
Cromatografía en columna
La fase estacionaria
esta empacada
dentro de un estrecho
tubo a través del cual
la fase móvil es forzada
por presión o por
gravedad

mnnb
 Término Definición
Solvente Líquido (fase móvil) de polaridad diferente a la fase
estacionaria
Revelador Algún líquido con mayor afinidad a la fase estacionaria
que a la fase móvil, pero menor que el soluto capaz de
avanzar a traves de la columna

Efluente Líquido que sale de la columna

Eluente Líquido que tiene menor afinidad a la fase estacionaria
que con los solutos per con capacidad de moverse
con ellos fuera de la columna

Eluato Fracción de eluente que contiene la cantidad

requerida de sustancia
Volumen de Volumen de la fase móvil que sale de la columna antes
retención de la sustancia específica
 FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LA
CROMATOGRAFÍA
t=0

t=x

Por qué se produce un avance diferencial a lo

largo de la columna de las distintas fracciones de
solutos inyectados ?.
Qué sucede dentro de la columna para que unas
moléculas queden más retenidas que otras?.
Constante de distribución ( K )

CS
K = ---------- (1)
CM

CS : Concentración molar del analito en la fase

estacionaria
CM : Concentración molar del analito en la fase móvil .
CROMATOGRAMA
Registro de la señal de detección en función del tiempo de
elusión o del volumen.
Tiempo de retención ( t r )
 Tiempo que la muestra permanece dentro de la columna.
 Se mide desde el momento en que la muestra se introduce
en el sistema hasta el momento en que se obtiene el punto
máximo de la señal.

Tiempo muerto ( t m )
 Es el tiempo requerido para eluir una muestra no retenida en
la columna .
 Se determina midiendo el tiempo de retención de la fase
móvil misma, o bien una muestra similar.
Velocidad lineal media de migración del analito (v)
L
v = ---------- (2)
tr
Velocidad lineal promedio de la fase móvil ( μ )
L
( μ ) = ---------- (3)
tM

Relación entre el tiempo de retención y la constante de

distribución

v = µ x fracción de tiempo que el analito reside en la fase móvil

 moles del analito de la fase móvil
v = µ x -----------------------------------------------------
moles totales del analito

C M VM 1
v = µ x ------------------------ = µ x ---------------------------------
CM VM + CSVS 1 + (CSVS) / (CM VM )
1
v = µ x ------------------------ (4)
1 + (KVS) / VM

Velociad de migración del soluto: Factor de capacidad (K’)

Parámetro importante frecuentemente empleado para describir las
velocidades de migración de los analitos en las columnas.
Para una especie A :
 KA VS
K´ A = ----------------- (5)
VM
Sustituyendo la ecuación 5 en la ecuación 4:
1
v = µ x ---------------- (6)
1 + K´A

Para determinar K´ a partir de un cromatograma, se reemplaza las ecuaciones 2

y 3 en la ecuación 6 :
L L 1
------ = ------ x ------------------- (7)
tR tM 1 + K´A
Al reordenar:
tR tM
K´A = ---------------- (8)
tM
 C S VS
K´ = -------------------
C M VM

K = CS / CM

VS tr – tm t´r
K´ = K -------------- = --------------- = ---------
VM tm tm
Velocidad de migración diferencial: Factor de selectividad ( α )
El factor de selectividad de una columna para dos especies A y B,
se define como: KB
α = ----------- (9)
KA
α: Siempre es mayor que la unidad
En base al factor de capacidad:
K´B
α = ----------- (10)
K´A
Reemplazando la ecuación 8, en la ecuación 10 y ordenando
( tr ) B - tM
α = --------------------- (11)
( tr ) A - tM
METODOS PARA DESCRIBIR LA EFICACIA DE LA
COLUMNA

Se utilizan dos términos :

 La altura de plato ( H ) y
 El número de platos teóricos ( N )
Los dos están relacionados por la ecuación :

N = L / H (12)
Plato teórico:
Medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que
consiste en tratar una columna, como si estuviera compuesta de
pequeñas zonas o platos, en las que tiene lugar el reparto entre las
fases móvil y estacionaria
Definicion de altura de plato
Generalmente se asume que las bandas cromatográficas tienen
una forma gausiana.
Por ello es conveniente definir la eficacia de una columna en
términos de varianza por unidad de longitud de columna.
Luego:
σ2
H = ------------- (13)
L

Esta definición se ilustra en la figura siguiente, donde se muestra una

columna con un relleno de L cm
 La altura de plato puede pensarse como la longitud de la columna
(al extremo de la columna) que contiene una fracción del analito
comprendida entre L – σ y L.
 Debido a que el área bajo la curva, de error normal limitada por ±
σ es aproximadamente el 68 % del área total, una altura de plato,
tal como se ha definido, contiene un 34 % del analito

Evaluación experimental de H y N

La figura siguiente muestra un cromatograma característico

 La varianza del pico del analito, tiene unidades de segundos al
cuadrado y se designa por ζ2
 Las dos desviaciones estándares se relacionan por
σ
ζ = ------------- (14)
L / tR.
L/tR. : Velocidad lineal promedio de las especies en cm/seg
 Casi el 96 % del área bajo un pico gausiano se encuentra
dentro del intervalo comprendido entre más y menos dos
desviaciones estándar (± 2 σ), alrededor de su máximo.
 Las intersecciones tienen lugar a una distancia del máximo
de aproximadamente ± 2 ζ, y W = 4 ζ ; W base del triángulo.
 Al sustituir y ordenar la relación anterior en la ecuación 14, se
tiene
LW
σ = ------------- (15)
4tR.
 Reemplazando la ecuación 15 en la ecuación 13, se
tiene:
LW2
H = ----------------- (16)
16 tR2
Al sustituir en la ecuación 12, y reordenando se tiene :
tR
N = 16 ( ------- ) 2
W
OPTIMIZACION DE LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Una separación cromatográfica se optimiza variando las
condiciones experimentales hasta que los componentes de una
mezcla se separan totalmente en el menor tiempo posible.
Los objetivos de la optimización son :
 Reducir el ensanchamiento de la zona.
 Modificar las velocidades relativas de migración de los
componentes.
Resolución de la columna ( R S )
Medida cuantitativa de la capacidad de la columna para
separar dos analitos.
La resolución de una columna se define como :

∆ Z
RS = -----------------------------
WA / 2 + WB / 2
2∆Z
RS = -----------------------
WA + WB

2 [ (tR)B - (tR)A]
RS = ------------------------------------
WA + WB
Influencia de los factores de capacidad y selectividad sobre
la resolución.
La ecuación es la siguiente :

(N)½ α - 1 K´B
RS = ----------- ( --------------- ) ( ---------------- )
4 α 1 + K´B

mkuyrs
APLICACIONESDE LA CROMATOGRAFIA
Análisis Cualitativo
Un cromatograma proporciona solamente una parte de la
información cualitativa correspondiente a las especies de la
muestra ; su tiempo de retención.
Análisis cuantitativo
Análisis basados en la altura de pico.
La altura se obtiene uniendo las líneas de base de cada pico por
una línea recta, y midiendo la distancia perpendicular desde
esta línea al máximo del pico.
- La precisión es buena.
-Las alturas de pico están inversamente relacionadas
con la anchura de pico
- Las variables a controlar son : La temperatura de la
columna, el caudal del eluyente y la velocidad de
inyección de la muestra

Análisis basados en las áreas de pico.

- Son independientes de los efectos de
ensanchamiento .
- Parámetro analítico más adecuado que las
alturas.
CX / CS = AX / AS
Ejemplo:
Se analiza una muestra de 4.00 mL de sangre de un
paciente del cual se sospecha que sufre de Cetoniasis
para acetona mediante la extracción de la muestra con
25 mL de CHCL3. La partición de la acetona es tal que
la fracción del analito en la fase orgánica es de 0.970.
Calcule la concentración de acetona en la muestra de
sangre, en unidades de mg de acetona por 100 mL de
sangre, sabiendo que si se inyecta una alícuota de
5,00 µL del extracto de clororformo en una columna
cromatográfica, se obtiene un pico de 70.00 mm2, en la
cúál la inyección de 5,00 μ L de un estándar que
contiene 61.1 μg de acetona por 10 mL produce un pico
de 44,0 mm2.
Solución : 6.2629 mg de acetona / 100 mL de
sangre .
Calibración y patrones.
- Se preparan una serie de disoluciones patrón de
concentración conocida.
- Se obtiene los cromatogramas correspondientes.
- Se plotean las alturas o las áreas de pico en función
de las concentraciones

mnhgr
Ejemplo:
Se analiza el contenido de colesterol de un huevo
mediante HPLC empleando la técnica de la curva
estándar. Para ello se toman 1.0109 g de yema y se
somete a extracción con potasa metabólica y luego a
una extracción con isopropanol, y el rendimiento de
extracción de esta etapa fue del 90 %. Al fianl el
colesterol se recupera en un volumen de 50 mL de
isopropanol y se inyecta en la columna del equipo. Con
los datos siguientes, determine el contenido de
colesterol en mg / g de yema de huevo.
Colesterol (ppm) 1.5 1.8 2.1 2.4
Area de (cm2) 9.9 11.9 13.0 14.3
Area de pico de la muestra 12.2 cm 2

16
y = 3.6286x + 5.4714
Area ( cm 2 )

14 2
R = 0.9963
12
10
8
1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6
ppm colesterol

Curva estándar para colesterol

Método del estándar interno
- Se consigue mayor precisión, puesto que se evitan
incertidumbres producidas en la inyección de la
muestra.
- Se introduce en cada estándar y en la muestra una
cantidad exactamente medida de una sustancia
estándar .
- La relación de las áreas o alturas del analito y del
estándar interno sirven como parámetro analítico
- Se requiere que el pico del estándar esté bien
separado de los picos de los demás componentes de la
muestra ( RS > 1.25 ).
- El tiempo de retención debe ser cercano al del
compuesto problema, pero sin interferir.
- Debe ser inerte y no formar parte de la muestra.

Am / As

Cm / Cs
Con los siguientes datos, obtenga la concentración de
un analito Y:
Cm/Cs : 0.33 0.67 1.00 1.33 1.67
Am / As : 2.30 5.00 8.60 11.50 13.70

y = 8.7693x - 0.5493
2
15 R = 0.9935
Am / As

10

0
0 0.5 1 1.5 2
Cm / Cs
Curva estándar interno