ELECTROFORESIS
• Cromatografía
• ELECTROFORESIS
• ADN Recombinante
INTRODUCCIÓN Arne Tiselius
1937
ELECTROFORESIS (Nobel 1948)
Separar y analizar moléculas: proteínas
ADN/ARN
... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico
(dependerá de su carga eléctrica)
cátodo ánodo * Moléc. (+) polo (-) o cátodo
* Moléc. (-) polo (+) o ánodo
ELECTROFORESIS LIBRE
moléculas en disolución o suspensión:
poco resolutiva
SOPORTE ánodo
ELECTROFORESIS DE ZONA
SOPORTE que retiene las moléculas:
elevado poder de resolución
cátodo
EQUIPO ELECTROFORÉTICO
fuente de cable Componentes:
alimentación
cátodo ánodo * Fuente de alimentación
- muestra +
electrodo
electrodo gel
* Dos electrodos
ánodo (+)
cátodo (-)
(E. horizontal)
cubeta tampón
electrodo muestra * Cubeta
cátodo
-
* Tampón de electroforesis
cubeta * Soporte electroforético
cable
(gel)
ánodo gel
+
fuente de
alimentación
(E. vertical)
tampón
FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
1_ Campo eléctrico
*Diferencia de potencial: voltaje (V-voltios)
*Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica
depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R-ohmios): determinada por el soporte y tampón
electroforesis
*Temperatura: efecto Joule refrigerantes
2_ Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño
*Forma: formas globulares avanzan más
3_ Tampón de electroforesis
*pH: determina la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico moléculas (-)
*Fuerza iónica: moderada (0.05 o 0.1 M) para que no interfiera
4_ Soporte
SOPORTE ELECTROFORÉTICO
Características
Gel poroso (entramado tridimensional interno)
Tiene que permitir el paso de moléculas
Material inerte: NO puede estar cargado y no
debe adsorber las moléculas de la muestra
Gel poroso
Tipos de Soporte
No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento
a su paso separación sólo por CARGA
* Electroforesis de proteínas: • Acetato de celulosa, papel, almidón,
agar
Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su
paso separación por tamaño (tamizado molecular)
* Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO
• Acrilamida
* Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO
• Agarosa, acrilamida
EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Electroforesis horizontal
muestra
Strip
+ Avance de las proteínas -
Campo eléctrico (∆ V)
1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Negro amido
4. Densitometría
Aplicaciones diagnósticas en serología
(separación proteínas séricas)
EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA
Feline: Feline Feline: Lymphosarcoma
Infectious Peritonitis
Canine: Leishmaniosis
Equine: Chronic Equine: Inmunodeficiency
Hepatitis + Pneumonia
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida
* Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida
* Variación de la concentración variación del tamaño de poro
[poliacrilamida] tamaño poro
Electroforesis vertical
1. Preparación del gel
2. Montaje de la cubeta
3. Aplicación de la muestra
4. Electroforesis
5. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Sales de plata
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Ventajas:
* Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO
* Químicamente inertes
* Transparentes (permite densitometría)
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura)
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme
Aplicaciones:
* Separar proteínas
* Determinar peso molecular de una proteína SDS-PAGE
* Separar proteínas oligoméricas
* Separar proteínas en función de su pI Isoelectroenfoque
* Separar proteínas de mezclas muy complejas Electroforesis 2D
* Ver si hay una proteína en concreto Western Blot
SDS-PAGE
Condiciones de la PAGE:
* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO PAGE
* Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO SDS-PAGE
Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea,
reductores (DTT, β -mercaptoetanol)...
• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)
todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño
- - - -
-
+ SDS - -- - -
- - - - - - - --- - --
- S-S - S-S - - - -
44 kDa
- - S-S -- -
S-S
S-S
S-S
PM = 50 kDa
+ SDS
+ DTT - --- - - -
- - - - - - --- - 25 kDa
SDS-PAGE: determinación del peso molecular
Marcadores de peso molecular:
* Mezcla de diferentes proteínas
pre-teñidas de las que conocemos el
peso molecular.
* Por comparación podemos averiguar
el PM de nuestra proteína.
ISOELECTROENFOQUE
* Separación de proteínas según su punto isoeléctrico (pI)
pI es el valor de pH en el que la carga de la proteína = 0
si pH > pI: carga (–)
si pH < pI: carga (+)
* Gel de poliacrilamida (PAGE) con gradiente de pH.
+ + + Proteínas migran hasta
pH 2 A B
(ácido)
la zona del gel donde
+ + pH=pI de la proteína
GRADIENTE DE pH
A B A
0 + 0 pH 6
B Prot A pI=6
0 pH 7 Prot B pI=7
pH 10
(básico)
- - -
ELECTROFORESIS 2D
* 1ª dimensión: ISOELECTROENFOQUE separa por pI
* 2ª dimensión: SDS-PAGE separa por PM
1ª DIMENSIÓN 2ª DIMENSIÓN
ELECTROFORESIS 2D
WESTERN BLOT
* Técnica immunológica interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac)
* Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de
anticuerpos específicos (muy sensible)
1. SDS-PAGE Electroforesis
2. Transferencia a membrana 3. Incubación con los Anticuerpos
proteínas proteínas
2dario
proteína
HRP interés
1ario
Resultado
SDS-PAGE Western BLOT
4. Revelado
SUSTRATO
proteína
HRP
interés PRODUCTO LUZ
Todas las Proteína
proteínas de interés
WESTERN BLOT
* Técnica immunológica interacción PROTEÍNA-PROTEÍNA (Ag-Ac)
* Detectar en una mezcla una proteína concreta mediante el uso de
anticuerpos específicos (muy sensible).
SDS-PAGE:
Resultado
SDS-PAGE Western BLOT
WESTERN BLOT:
Todas las Proteína
proteínas de interés
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Soporte: (restrictivo)
* Gel de Agarosa moléculas grandes (0.1-60 kpb)
* Gel de Poliacrilamida moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida)
Separación sólo por TAMAÑO
Densidad de carga igual para todas las
moléculas por los grupos fosfato
Ácidos nucleicos = carga (-)
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Aplicaciones:
* Separar, identificar y purificar fragmentos
de DNA o RNA
* Determinar tamaño de un fragmento de DNA Gel de agarosa
* Separación de cromosomas enteros
* Secuenciación de DNA
* Identificación de regiones de unión a Gel de poliacrilamida
proteínas
* Detectar la presencia de un gen (o secuencia
Southern Blot
específica de DNA) en una muestra
* Determinar si se expresa un gen específico Northern Blot
EN GEL DE AGAROSA
Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa
Electroforesis horizontal
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (∆ V)
1. Preparación del gel
2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
EN GEL DE AGAROSA
Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa
Electroforesis horizontal
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (∆ V)
1. Preparación del gel
2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
SOUTHERN BLOT
* Interacción DNA-DNA (hibridación por complementariedad de cadena)
* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Detectar la presencia de un gen, etc.
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA
moléculas de DNA
32
P
de DNA …TAACGT…
DNA
…ATTGCA… interés
Resultado
Gel Agarosa Southern BLOT
4. Revelado
DNA
interés
32
P
Todos los DNA
DNA de interés
NORTHERN BLOT
* Interacción RNA-DNA (hibridación)
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Expresión génica
1. Electroforesis en gel de agarosa
3. Hibridación con la sonda radioactiva
2. Transferencia a membrana
Sonda
moléculas de DNA
moléculas de RNA
32
P
de RNA …TAACGT…
RNA
…AUUGCA… interés
Resultado
Gel Agarosa Northern BLOT
4. Revelado
RNA
interés
32
P
Todos los RNA
RNA de interés
Links a simulaciones de electroforesis:
- En tira de acetato de celulosa:
http://sebbm.bq.ub.es/BioROM/contenido/biomodel/lab/acetato/inicio.htm
- En gel de poliacrilamida
http://biomodel.uah.es/lab/sds-page/inicio.htm
- En gel de agarosa:
http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis.swf
http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/elfo/electrof.html
