http://www.dnai.org/text/mediashowcase/index2.html?
id=1022
ADN Recombinante célula
cromosoma
Se toma el plásmido de una levadura, se corta
con una enzima de restricción, y se inserta en
levadura
él ADN humano que codifica para una
proteína dada. El plásmido híbrido resultante
se puede insertar en otra levadura, donde se ADN
multiplicará junto con ella.
TCGA
AGCT
AGCT
TCGA
Genes
celulares
proteína
Cámara de alimentación
Genes de la levadura
Multiplicación del plásmido y expresión del gen
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/plasmidcloning_fla.html
Se considera una proteína recombinante o
proteína heteróloga aquella proteína cuya
síntesis se realiza en un organismo distinto al
organismo nativo.
EcoRI
http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0
http://www.youtube.com/watch?v=RgYt99b3sjQ
Palíndromo, Enzima de Restricción, Extremos pegajosos
Arber, Nathans, Smith (1978)
No daré radón, Anilina Extremos pegajosos
(o Cohesivos)
GAATTC G AATTC
GAATTC AATTC G
EcoRI
G AATTC
G AATTC
Ganas Admiración Ante Todos Tus Colegas
Corte específico y Ligamiento del ADN
GAATTC GAATTC
CTTAAG CTTAAG
EcoRI
G AATTC G AATTC
CTTAA G CTTAA G
G G AATTC AATTC
CTTAA CTTAA G G
Extremo cohesivo EcoRI EcoRI extremo cohesivo
ADN Ligasa
G AATTC
CTTAA G
Codones
raros parada
inicio
ADNc
Marcador elegible MCS Origen F1 de replicación
Origen de replicación represor
Inserción al microorganismo o
célula superior
Disparo de
proyectil
inyección
virus
transformación
transgen
Un sistema de expresión lo conforma un organismo hospedero y un vector de
expresión o fragmentos de DNA que poseen los elementos génicos necesarios para
realizar los procesos de trascripción y traducción en dicho organismo hospedero.
Purificación
FPLC
Gen Secuencia
humano promotora para la
síntesis de una
proteína de la leche
Gen híbrido
humano rata
Óvulos de cerda
fecundados
desarrollo de
una cerda
transgénica
No me digas
q ella no es
Transgénicos
transgénica
Cabras transgénicas portadoras de un gen humano.
a) se produce un transgén,
b) se realiza una fertilización in vitro,
c) se inyecta el gen transgénico en el cigoto,
d) se implanta el embrión en una madre sustituta.
Transgénicos
maduración retardada, piel más
gruesa, resistencia a las plagas
Patatas resistentes al escarabajo, Resistentencia a herbicidas
menos de aceite para freirlas e insectos
Harina de trigo de
mejor calidad
Hay 2 métodos principales para transformas las células y tejidos de las plantas:
La pistola de genes. Esta técnica es aplicada especialmente en la transformación de especies
monocotiledóneas como el Maíz y el arroz.
Método con Agrobacterium. Aplicada en dicotiledóneas y en monocotiledóneas. En general esta
técnica es preferible que la pistola de genes porque es mayor la frecuencia de inserciones en un solo
sitio de ADN extraño, lo cual facilita la vigilancia.
La bacteria Agrobacterium tumefaciens contiene un plásmido Ti, que
contiene los genes responsables de su virulencia, llamados genes onc.
Cuando la bacteria infecta a la planta, provocando en ella un tumor,
una parte del plásmido Ti, llamada T-ADN, que contiene los genes onc,
es transferida al núcleo de la célula vegetal y se inserta en un
cromosoma de la planta.
En la transfección vegetal con Agrobacterium se ha
ensayado un marcador inusual: el gen de la enzima
luciferasa, de las luciérnagas. El sustrato de esta enzima
es una proteina llamada luciferina, que con ATP y
oxígeno desprende luz. Plásmidos Ti con este marcador,
se transfirieron a células de tabaco, con las que se
formaron nuevas plantas.
El Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) es la institución que más trabajo tiene
en la aplicación de biotecnología y especialmente en el desarrollo de cultivos transgénicos.
clonación
Esquema de producción de
proteínas recombinantes
Envasado y
comercialización
Recuperación del
recombinación producto
Cultivo celular
Biorreactor de escala piloto
Biorreactor de
pequeña escala
Operación a escala industrial
PDI
Los puentes S-S son enlaces
covalentes ( 2.08Å).
Formación de un PDI PDI
enlace disulfuro PDI
Proteina reducida Proteina oxidada
rearreglo de enlaces
disulfuro
PDI PDI
PDI
Proteina con puentes Proteina con puentes
disulfuro incorrectos disulfuro correctos
Oligosacárido Hélice a
dolicol transferasa calnexina transmembrana
citosol Hélice a
luminal
Luz del RE
2 3
1a
PDI 1b
monómero de la Trímero de la
hemaglutinina hemaglutinina
calreticulina completado
Propiedades Químicas y
Biológicas de la Proteína
Es importante analizar:
La posible toxicidad sobre el hospedero
La estabilidad al pH, temperatura y proteólisis
Su secuencia nucleotídica codificante para evaluar el uso de codones preferenciales y
la presencia de secuencias de finalización prematura de la transcripción.
La secuencia aminoacídica para evaluar el peso molecular, y el punto isoeléctrico
Tipo de modificaciones postraduccionales presentes
El destino celular deseado (extracelular o intracelular) y el grado de pureza deseada.
Alimentos
Procesos industriales
Aditivos
Nutracéuticos
Suplemento alimenticio
Biomedicina
Química de la transformación
Reactivo diagnóstico
Industria del papel
Agente terapéutico
Industria textil y del cuero
Vacunas
Industria farmacéutica
Industria química
Reactivo químico Medio ambiente
Reactivo analítico Energía y combustibles
Tratamiento de residuos
DESVENTAJAS
VENTAJAS Ineficiente secreción de la proteína
al medio de cultivo.
Fácil manipulación.
Formación de cuerpos de inclusión
Buen nivel de conocimiento insolubles en el citoplasma celular.
sobre su fisiología y genética.
La síntesis de las proteínas
Se cuenta con gran variedad de heterólogas induce a un incremento de
vectores de expresión y cepas la proteólisis celular.
mutantes.
Realiza pocas modificaciones
Cultivos baratos con altas postraduccionales.
densidades celulares.
Generación de endotoxinas dañinas
Niveles moderados de para la salud humana y animal.
producción de la proteína
recombinante.
Bacillus subtilis
VENTAJAS DESVENTAJAS
Secreción de la proteína Secreta una gran cantidad de
heteróloga. proteasas afectando el rendimiento
del producto recombinante.
Dispone de pocos vectores de
expresión y elementos promotores
para la regulación de la expresión de
los transgenes comparado con E. coli.
Menor estabilidad genética de los
plásmidos incorporados en el
hospedero.
Bacillus subtillis que ha sido exitosamente transformado con el vector pTG262-plac-RFP
Saccharomyces cerevisiae
VENTAJAS
Sistema eucariota mejor caracterizado desde el
punto de vista de la Biología Molecular y la fisiología.
Genoma totalmente secuenciado.
Vectores de expresión y cepas disponibles.
Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e
industrial.
DESVENTAJAS
Cultivos baratos.
Produce hiperglicosilaciones.
Se producen altos niveles de la proteína
recombinante. Baja eficiencia en la secreción de
la proteína heteróloga.
Realiza modificaciones postraduccionales.
Es considerado como organismo GRAS.
Pichia pastoris
VENTAJAS
Emplea los promotores más fuertes y eficientemente
regulados de los conocidos.
Vectores de expresión y cepas disponibles.
Manipulación sencilla a nivel de laboratorio e
industrial.
Secreción eficiente de la proteína heteróloga.
Medios de cultivos son baratos y formulados libre de
DESVENTAJAS
toxinas y pirógenos.
Produce patrones glicosilaciones no deseables
Los cultivos alcanzan altas densidades celulares. para algunas proteínas.
Altos niveles de producción. Actividad proteolítica.
Bajos niveles de secreción de proteínas endógenas Algunas proteínas no se producen de forma
facilitando la purificación de la proteína heteróloga. eficiente.
Pichia pastoris, Aspergillus nidulans,
Día 1
Trichoderma reesei
Día 2
Día 3
Días 4 y 5
Preparación
Usario de lote Inicio de
de semilla Cultivo primario Inicio de
Banco de Preparación del Cultivo
células biorreactor y la secundario
80 ºC autoclave Biorreactor
en circuito Inicio en
biorreactor
Generación
de biomasa
(glicerol) Generación
de producto
(etanol)
Producción de Proteína en Células de Mamíferos
Transferencia del gen cribado Desarrollo del proceso
Proteína o.i.
marcador
seleccionar
Línea celular
clonal
Mínimo 12 meses
Es posible el cultivo continuo a gran escala
requieren una superficie sólida sobre la cual crecer (discos, cuentas de celulosa, etc)
las tasas de crecimiento y las densidades celulares máximas son muy inferiores a las
de las células animales
el enfoque más costoso para la producción de proteína recombinante
“Pharming” - proteína recombinante de animales vivos
animal transgénico (ovejas, cerdos, etc; caro de producir pero costo-efectivo)
Ejemplo gen de lactoglobulina (secreción de proteínas correctamente modificadas)
Insulina
SCID
Hay varios tipos de SCID. El más común es
causado por una mutación en el gen SCIDX1
localizado en el cromosoma X. Este gen
codifica una proteina utilizada para construir
el IL2RG (receptor de la interleuquina-2).
Otra forma de SCID es causada por una Diagrama en cintas de la
mutación en el cromosoma 20 y se adenosina desaminasa bovina . El
caracteriza por una deficiencia de la enzima ion Zinc visible en el centro.
adenosina desaminasa. Tomado del PDB 1VFL
2'-Desoxiadenosina
adenosina
desaminasa
2'-desoxi-inosina
Gen clonado
SCID (alelo normal)
Se inserta el
gen normal en
el virus
Ácido
nucleico viral
Retrovirus
Se infecta la célula
de la médula ósea
con el virus
ADN viral insertado
en el cromosoma
Célula de la médula
ósea del paciente
médula
ósea
Síndrome del Niño Burbuja
Se Inyectan células
al paciente
Superficie
HMWK
Cascada de la coagulación PK
XII VII
XIIa
Ca++ XIa
HMWK VIIa + TF
Ca++
XI IXa
IX
Ca++ Lesión vascular
VIII VIIIa PL
X
Xa
X
V Va Ca++
PL
protrombina
trombina
XIII
fibrinógeno monómero de fibrina
XIIIa
Polímero de fibrina
Polímero cruzado de fibrina
Imagen Computarizada del Interferon-g
Vacunas
Extracción del
ADN de virus Integración del plásmido
híbrido en el núcleo de una
célula de levadura
ADN
Plásmido
bacteriano
La levadura fabrica las
proteínas víricas con poder
inmunológico
Inyección de proteínas
víricas en un chimpancé
Envenenamiento por Organofosfatos
Los organofosfatos son esteres, amidas, u otros derivativados de los
ácidos fosfórico y tiofosfórico e incluyen algunos de los más tóxicos
insecticidas utilizados en la agricultura.
enzima
Inhiben la acetilcolinesterasa. OPDA
paratión
La terapia enzimática para el envenenamiento por
organofosfatos depende de la disponibilidad de cantidades
grandes de colinesterasas.
Las plantas transgénicas han sido evaluadas por su costo-
efectividad para la bioproducción de proteínas.
El tratamiento
convencional emplea
atropina y 2-PAM
H
C N OH
N+
Cl
CH3
pralidoxima o 2-piridina
cloruro de metilo
aldoxima
acetilcolinesterasa humana
