Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Bioquímica y Biología Molecular
“Determinación de aminoácidos terminales con grupos alfa amino libres por el
método de Sanger”
Juárez Castillón Luis Enrique Moreno Hernández Leonardo
Grupo 3IV1 Sección 4
Objetivo:
Esquema del cromatograma obtenido
Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las
cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el
método de Sanger.
Interpretación de cada paso efectuado en la
preparación del derivado dinitrofenilado:
•Se colocaron 30 mg de hemoglobina para ser disueltos en
2.4ml de bicarbonato de sodio al 4.2%, ya que se necesita
un medio de reacción alcalino, debido a que se debe
desprotonar al grupo alfa-amino libre y de esta manera se
facilita la reacción con el 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno
(DNFB).
•Posteriormente se adicionaron 2ml de DNFB al 1%, y se
procedió a agitar la suspensión vigorosamente durante 1
hora, esto con el fin de llevar a cabo la dinitrofenilacion
Imagen 1. Cromatograma. Se colocaron Muestra Problema,
entre un pH de 8 y 9, para poder formar un derivado de
DNFB, DNP Val, DNP Ala, DNP Phe, de izquierda a derecha
color amarillo que recibe el nombre de 2,4-dinitrofenil
respectivamente.
aminoácido (DNP-aa).
•Seguidamente se reajusto el pH debajo de 3 mediante la
adición de 12 gotas de HCl al 3N, esto con la finalidad de Resultados de los valores Rf obtenidos:
protonar el nitrógeno del amino terminal y proteger o hacer
más estable el enlace (C-N), y así cuando se hidrolice la
proteína no se romperá este enlace. .
•Se realizaron 3 extracciones de la suspensión amarilla, a
través de una solución de éter saturado con sulfato ferroso
para eliminar la fracción de DNFB que no reacciono con la
hemoglobina ni con los grupos imidazol que pudiesen estar
presentes en la cadena polipeptídica de la hemoglobina.
Se presentaron 2 fases en el tubo muestra. En la fase Derivados D recorrida Rf
acuosa estaban contenidos el DNP-aa de interés y demás dinitrofenilad (cm)
derivados dinitrofenilados a causa de su alta polaridad, os de los
mientras que en la fase orgánica se colecto el DNFB
sobrante y se extrajo.
aminoácidos
•El vaso de precipitados donde se colecto la hemoglobina, DNFB 25.3 0.5622
se calentó en la parrilla eléctrica y se agito, esto con la
finalidad de evaporar los residuos de éter que pudiesen
haber quedado. DNP-Asp 32 0.7111
•Se añadieron 5ml de HCl al 6N al tubo que contenía la
proteína dinitrofenilada y se le sometió a una presión en
autoclave durante 3 horas con la finalidad de realizar una DNP-Val 34.9 0.7755
hidrolisis acidan y de esta forma fraccionar, mediante la
ruptura del enlace peptídico a cada uno de los
aminoácidos de la hemoglobina, sin embargo manteniendo DNP-Phe 30.7 0.6822
estable la interacción entre el dinitrofenilo y el grupo
amino.
•Se repitieron por segunda vez, otra serie de extracciones Problema 35.1 0.78
con éter y FeSO4, donde la primera fase fue la fase acuosa
(parte con carga) que se desecha por contener derivados
dinitrofenilados altamente polares y la fase de interés es la
fase etérea (parte sin carga) que al ser hidrófobo se
recogió y se recolecto en un vaso de precipitados para
evaporar el éter restante en la muestra.
•Para concluir se preparó un cronograma y se adiciono
etanol al vaso de precipitados para hidratar el DNP-aa y
Discusión:
Al observar la cromatografía realizada, se puede observar
que la formación de manchas amarillas localizadas a
diferentes longitudes, se debe a que este método de la
cromatografía es un proceso de separación, que mediante el
uso de muestras patrón, se puede comparar y observar que
componentes estaban en la muestra. En nuestro caso de la
determinación del amino terminal, se usaron muestras de
aminos dinitrofenilados conocidos y se dejaron correr en el
cromatograma junto a la muestra problema y después de
obtener los valores de Rf correspondientes, se observa una
similitud entre el amino nitrofenilado DNP-Val con la muestra
problemas por lo tanto la valina es el aminoácido N-terminal
de la hemoglobina, ya que esta contiene valina en sus
cadenas como amino libre y se comprueba físicamente ya
que los resultados en el cromatograma, de la relación de
Reacción de DNFB con Histidina
frentes es muy similar.
Conclusión:
El aminoácido N-terminal de la hemoglobina es la Valina , La
técnica de Sanger nos permitió extraer dicho aminoácido.
Bibliografía:
•Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger
“Principios de Bioquímica” 4ª Edición. Ed. Omega
•Miester. A(1965).Bioquímica de aminoácidos. New York
Academic Press Inc.
•Varki A, Cummings R, Esko J, Freeze H, Stanley P, Bertozzi
C, Hart G, Etzler M. Essentials of glycobiology (2008) Cold
Spring Harbor Laboratory Press; 2ª ed.
•Edman, P. Acta Chem. Scand. 1950, 4, 283.
Preguntas Extra:
Degradación de Edman.
La degradación de Edman, desarrollada por Pehr Edman, es
un método de secuenciación de aminoácidos en un
péptido.1 En este método, el residuo amino terminal se
etiqueta y se separa del péptido sin afectar a los enlaces
peptídicos entre los otros residuos.
Mecanismo.
En medio básico, se provoca la reacción del extremo amino
con fenilisotiocianato para formar un péptido
feniltiocarbamilado. A continuación, se aplica un medio ácido
para que el tiocarbamoílo forme un ciclo de 5 miembros
(feniltiohidantoína) con el carbonilo del enlace peptídico
adyacente. De este modo, se obtiene un péptido más corto,
con un nuevo extremo amino y la feniltiohidantoína del
primer aminoácido.
