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148 vistas41 páginasGuía Completa de Cromatografía Líquida HPLC
Este documento proporciona una introducción a la cromatografía líquida, describiendo los componentes clave de un sistema HPLC como la bomba, el autosampler, el compartimento de columna y los detectores. Explica los tipos de columnas, cómo usarlas correctamente y mantener los registros apropiados. También cubre conceptos como los tipos de separación cromatográfica, solventes adecuados y precauciones para el uso seguro de las columnas.
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Rachel HillDerechos de autor
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CROMATOGRAFÍA
LÍQUIDA
AGOSTO 2019
OBJETIVO
Reconocer los diferentes módulos en un HPLC y sus características.
Fundamentos de separación cromatográfica.
Columnas analíticas.
Diferentes tipos de columnas
Mantenimiento de columnas.
Registros involucrados
Cromatografía liquida:
DEFINICIONES
:
TIPOS DE
CROMATOGRAFIAS
LIQUIDAS
TIPOS DE
CROMATOGRAFIAS
SISTEMA DE HPLC
Bomba: -Binaria , cuaternaria.
Autosampler: Sistema de inyección de muestras. Según el loop que se emplee
los volúmenes de inyección varían desde 1uL a 500uL o más. Lo habitual es 1-
100 uL. Puede estar termostatizado o no.
Inyección manual
Compartimento de columna termostatizado o no.
Detector
Tipo de detectores
TIPS DE USO
FM: SE DEBEN USAR DESGASEADAS
Y LIBRE DE PARTICULAS.
Desgasear: proceso de quitar gases
disueltos en un liquìdo o solvente.
Se puede realizar por Ultrasonicado
(15-20 minutos) o Filtración a vacío
por 0,22um- 0,45um .
En los HPLC de KEMIA ,las bombas son cuaternarias, existen 4 canales para
colocar Fase Móvil. Cada Canal es para un DETERMINADO TIPO DE SOLVENTE.
CANAL A: SOLVENTES ORGANICOS
CANAL B: AGUA
CANAL C: Buffers
CANAL D: OTROS
SE DEBEN RESPETAR ESTOS CANALES.
BOMBA:
Se debe lavar periódicamente (cada 1hr aprox) los sellos
de la bomba, Seal wash.
Al encender la bomba se debe subir gradualmente el flujo
hasta el valor deseado. Ej.: para setear a un flujo de
1ml/min, primero debo setear ,0,3 ml/min ,una vez
alcanzado setear a 0,7 ml/min y luego setear a 1ml/min.
En el caso de los equipos Agilent setear acceleration time
en 10 mL/min*min.
TIPS DE USOS
Se puede usar de dos maneras diferentes:
AUTOSAMPLER
SISTEMA DE
INYECCION
Precauciones:
NUNCA colocar viales ni retirar mientras que el Sistema esté
realizando el proceso de inyección.
Verificar que los viales tengan septas ,sin perforación o sin
que se vea un orificio o esté parcialmente roto.
Compartimento
Columnas:
PRECAUCIONES:
Al colocar una columna en el compartimento ,se debe conectar en primera
instancia el extremo que viene del INYECTOR.
Se debe encender la bomba y colocar un recipiente en el otro extremo de la
columna. Dejar caer 10 gotas aprox ,apagar la bomba y conectar el otro
extremo.
SIEMPRE verificar que las conexiones en los extremos de la columna estén
firmes y al encender la bomba ,no deben perder .
Si los conectores están correctamente colocados ,la contrapresión del sistema
debe aumentar hasta un valor determinado. En caso de tener perdidas la
contrapresión no aumenta.
DETECTORES
DAD (DETECTOR ARREGLO DE DIODOS):
RANGO ENTRE 200-1000 nm.
con Referencia(resta de Background) o sin
Se puede usar
Referencia.
Ancho de banda(nm): por defecto puede ser 2 ó 4 nm.
Frecuencia de toma de datos: 0,5seg , 1 seg ,2 seg. A menor
frecuencia ,menos detalle y menor altura se obtienen del pico de interés.
A mayor frecuencia mejor detalle del pico ,aumenta el ruido.
MODOS DE SEPARACIÓN MÁS COMUNES en HPLC:
-ADSORCIÓN: La separación de las moléculas se da por fenómeno de
ADSORCIÓ[Link] Analito más afín por la fase estacionaria se retiene más.
REPARTO: Existen dos Tipos
A) LÍQUIDO –Líquido: ya en desuso por problemas de estabilidad y sangrado de
la columnas (Ej: Trietileglicol).
B) Fase ligada químicamente a un soporte “inerte”: Los soportes más usados
son Siloxanos .También existen soportes como alúmina y polimérica.
CARACTERISTICAS DEL MATERIAL DE SOPORTE:
-POLIMERICAS: RESISTEN RANGOS MAS AMPLIOS DE PH.
-Silanoles: son inertes químicamente, de alta pureza, tamaño de partícula
variado y reproducibles. Desventaja: a pesar de tener alta pureza presenta
incrustaciones de metales(ej.: Fe,Mn).
TIPOS DE COLUMNAS SEGÚN SU RELLENO
Columnas de Fase reversa (C8,C18,Fenilo)
-Los solventes empleados en las FM son: Agua,ACN,MeOH,Etanol, Buffers
acuosos, THF.
- Solventes como Cloroformo, Hexano, Diclorometano,etc no son los mas
adecuados.
Columnas de Fase Normal ( Sílice, Diol, Amino,Ciano)
Las FM contienen mayoritariamente solventes apolares: Hexano,Cloroformo,
Diclorometano.
Las columnas Amino y Ciano son usadas como fase normal o reversa
dependiendo de la FM.
Las columnas de SILICE ,SON DAÑADAS IRREVERSIBLEMENTE POR PRESENCIA DE
AGUA como componente de una FM.
Especificaciones Columnas Hypersil BDS c18
PRECAUCIONES CON LAS COLUMNAS ANALITICAS
Se debe leer el certificado adjunto a la columna con el fin de conocer DATOS
RELEVANTES (ej.: rango pH, Temperaturas máximas, Presión Máxima,
restricciones).
SE DEBE conocer y NUNCA superar la contrapresión MAXIMA permitida por el
fabricante.(400bar).
AL FINALIZAR la secuencia ,se debe agregar una secuencia de LAVADO.
EVITAR dejar las columnas analíticas con la FM ,en especial si contiene Buffers o
PAR IONICO.
Cada vez que se usa una nueva columna se DEBE chequear su PERFORMANCE con
la metodología de verificación de columnas usando la mezcla de parabenos.
Al alcanzar las 400hs de uso de debe realizar una limpieza profunda como indica el
instructivo de regeneración de columnas.
REGISTROS
Se DEBE registrar al momento de realizar el análisis:
A- LOGBOOK de uso del equipo correspondiente.
B- LOGBOOK de uso de columna (en formato Excel ubicado en
w:/EQUIPOS/Columnas HPLC.
C- Nro. de columna en el equipo.
D- Tiempo de retención y Relación Área/concentración del std1
E- LOGBOOK de registro de Fases Móviles
