“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCION E IMPUNIDAD”
PROFESOR:
Mg. Lisly Sedano
INTEGRANTES:
-Colan Paredes Diego
-Cumpa Ortiz Maryori
-De la Cruz Licas Pamela
-Pichiluingue
-Romero Castrejón Andrés
-Usquiano Zavala Esthefany
ANALISIS INSTRUMENTAL
2019
CROMATOGRAFÍA
La cromatografía es un método químico de separación
para la caracterización de mezclas complejas cuyo
objetivo es separar los distintos componentes, la cual
tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; es un
conjunto de técnicas basadas en el principio de
retención selectiva, cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos
componentes.
FUNDAMENTO
La cromatografía líquida (HPLC), es
una técnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla. Consiste
en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil.
FASE MÓVIL
La fase móvil actúa de portador de
la muestra. La muestra en solución
es inyectada en la fase móvil. Los
componentes de la solución migran
de acuerdo a las interacciones no
covalentes de los compuestos de
la columna.
LA FASE ESTACIONARIA (SILICA)
La muestra a analizar es introducida
en pequeñas cantidades y sus
componentes se retrasan
diferencialmente dependiendo de las
interacciones químicas o físicas con
la fase estacionaria a medida que
adelantan por la columna.
•VENTAJAS •DESVENTAJAS
-Velocidad de análisis -Instrumentación costosa
-Alta resolución -Difícil análisis cualitativo
-Resultados cuantitativos -No existe detector
-Buena sensibilidad universal y sensible
-Automatización -Elevado costo de
-Amplio espectro de operación
aplicaciones -Experiencia
indispensable
Aplicaciones:
Compuestos iónicos
Aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos
orgánicos, etc.
Compuestos de alto peso molecular
Polímeros, hidrocarburos polinucleares,
productos naturales, etc.
Compuestos termolábiles y no volátiles
Vitaminas, pesticidas, esteroides,
drogas.
Integrados: Cada una de sus partes están reunidas en un
gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes
es difícil.
Modulares: Los módulos son instrumentos individuales que
permiten no solo armar el equipo según las necesidades, sino
aumentar su complejidad según esa necesidad varíe.
COMPONENTES PRINCIPALES
Instrumentación
1)Reservorio. Contiene a la Fase Móvil.
2)Bomba. Impulsa a la Fase Móvil dentro del sistema de
elución de HPLC.
3)Inyector (Automuestrador o Manual). Permite introducir la
muestra al sistema.
4)Columna (Precolumna, Guardacolumna y Horno).
Sistema de análisis.
5)Detector. Es un transductor que tiene como función el
registro del paso de componentes de una muestra en el
orden en el que eluyen.
6)Colector de Fracciones. Sirve para recibir o contener por
separado los componentes que ya eluyeron por si se
requiere un análisis posterior de alguno de ellos.
7)Computador. Sistema de almacenamiento.
1.- CONSIDERACION DE RESERVORIO
Frasco cerrado de vidrio o de algún polímero resistente al disolvente
con paredes homogéneas.
Contiene un filtro de metal poroso que ayuda a retener partículas de
tamaño mayor a 10μm.
Previo al bombeo del disolvente hacia el sistema de HPLC, se realiza un
tratamiento por desgasificación por ultrasonicación o un burbujeo con un
gas inerte (He excelencia).
Consideraciones del Disolvente
El disolvente debe ser de alta pureza (grado HPLC).
Disolver el analito.
Tener baja viscosidad.
No debe reaccionar con el empaque de la columna.
Debe ser volátil.
Polaridad adecuada para el tipo de análisis que se lleve a cabo.
2.- BOMBAS
Impulsan a la FM hacia el sistema de HPLC.
Generan presiones de hasta 6000 psi (lb/in2).
Tienen flujo libre de pulsaciones, evitando así la variación
de presión dentro del sistema.
Tienen intervalos caudal de 0.1 a 10 ml/min.
Tipos de bombas Principio de la bomba reciprocante
Binarias: Impulsan un solo disolvente hacia el sistema.
Secundarias: Impulsan 2 disolventes hacia el sistema.
Terciarias: Impulsan 3 disolventes hacia el sistema.
Secundarias: Impulsan 4 disolventes hacia el sistema.
Elución Isocrática
Se mantiene la misma proporción de disolventes durante todo el proceso.
Elución en gradiente
La proporción de la mezcla de disolventes cambia en algún punto del
proceso.
Este tipo de elución se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de
componentes con polaridad diferente.
Permite introducir la muestra al sistema de Septum
HPLC para su análisis sin despresurizar el
3.- INYECTOR sistema y sin interrumpir el caudal
La muestra se introduce en el
“Loop”, el cual se encarga de Microjeringas de Inyección
introducir la muestra al sistema.
Tiene una posición de carga y otra de
inyección.
Generalmente se usa una válvula muestreadora con jeringa.
Válvula
muestreadora
PRECOLUMNAS
4.- COLUMNA Y PRECOLUMNA
Las precolumnas deben contener la
Es el medio donde se lleva a cabo la
misma FE que el empaque de la
separación y es el contenedor de la FE columna, este evita el posible ingreso
de partículas contaminantes y en Elución: el soluto es lavado de
general prolonga la vida media de la la columna por agregado de
columna. solvente
COLUMNAS DE VIDRIO
Tipos de columnas
• Diámetro interno 3.9 - 4.6
mm
• Longitud de 10, 15, 25, 30 cm
• Tamaño de partícula de 3.5,
5, 10 μm
CARACTERISTI
CAS DE
COLUMNAS
Detectores
5.- Detector UV/VIS
Funciona
únicamente Es altamente
Se encarga de Puede
para selectivo sobre
translucir la utilizarse en
compuestos posean que
energía emitida gradiente de compuestos
que
de un compuesto. elución.
absorban en dobles enlaces.
UV/VIS.
Regiones de absorción de luz
TIPOS DE HPLC
• Según el
fenómeno dentro
de la columna
SEGÚN MECANISMOS DE SEPARACIÓN
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
Equilibrios de adsorción-desorción de los
componentes.
Fuerza de adsorción (depende de la polaridad de
este, la actividad del adsorbente y la polaridad de la
fase móvil.
Se usa en compuestos de polaridad baja y media
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
CROMATOGRAFÍA POR TAMAÑO MOLECULAR
CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL:
CROMATOGRAFIA FASE REVERSA
Parámetros De Medición
Diámetro Columnas HPLC
• La cantidad de muestra que se
puede cargar a la columna y
también influye en su sensibilidad.
Las columnas de diámetro interno
más grande (>10mm) se utilizan
normalmente en la purificación de
compuestos para su utilización
posterior.
• En cambio, las columnas de
diámetro interno menor (4-5 mm) se
utilizan en el análisis cuantitativo de
las muestras, y se caracterizan por
el aumento la sensibilidad y la
minimización del consumo de
disolventes que conllevan.
Medida De Las Partículas
• se realizan con una fase
estacionaria unida al exterior de
partículas esféricas de silica.
Estas partículas pueden tener
diferentes medidas, siendo las
de 5µm de diámetro las más
utilizadas.
Tamaño Del Poro • TIPOS DE POROS
• Los poros pequeños proporcionan
una mayor superficie mientras que
los poros de mayor medida
proporcionan una cinética mejor,
especialmente para los compuestos
de tamaño más grande
Presión del sistema
Bomba reciproca
• La presión de las bombas es
variable según el modelo y
fabricante, pero su rendimiento se
mide en su habilidad para generar
un flujo constante y reproducible. La
presión puede lograr valores de
hasta 40 MPa
CARACTERISTICAS HPLC UPLC
Tamaño Partícula 3-5µ <2µ
Presión Máxima 35-40Mpa 100Mpa
Columnas Alltima c18 Acquity UPLC BEH C18
Dimensión De Columnas 150x3.2 mm 150x2.1 mm
Temperatura De 30℃ 65℃
Columnas
Volumen De Inyección 5µL 2µL
Rendimiento De Muestra Menor Mayor
Preparación De Muestra Simple Tedioso
Coagulación De Columna No toma lugar Toma lugar
Tiempo de Análisis Mayor Menor
Sensibilidad Menor Mayor
El HPLC es elegido debido a su alta sensibilidad, rapidez, versatilidad
y a la capacidad de detectar muchas sustancias como: aminoácidos,
proteínas, ácidos nucleicos, drogas, esteroide, plaguicidad y alguna
sustancias de origen inorgánico
Para una buena interpretación del cromatograma debemos tener
presenta el significado y lo que representa cada variable como el
tiempo muerto, el tiempo de retención, etc.
GRACIAS
