Importancia Clínica del Coombs Directo
Dr. Baldo Castro
Msc.. En Medicina Transfusional
Asesor Científico Hemocolombia
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA
PRUEBA DE ANTIGLOBULINA
• Robert Royston
Amos (Robin)
Coombs
PRUEBA DE COOMBS
1945 “Coombs, Mourant y Race, aportaron
algunas investigaciones sobre el
descubrimiento de anticuerpos anti-Rh, y
describieron el test de antiglobulina (TAG), que
utilizaba un suero antiglobulina humana
(AGH), preparado en conejos para detectar
anticuerpos Rh incompletos”.
PRUEBA DE COOMBS
• El suero de Coombs
son producidos por
la inyección de
globulinas humanas
(conejos o cabras)
que forman
anticuerpos contra
las Fracciones “Fc”
de las globulinas
humanas.
PRUEBA DE COOMBS
• El test de la
antiglobulina Humana, o
test de Coombs,
representa la forma más
importante de
aglutinación artificial en
inmunohematología.
SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA DE COOMBS
DIRECTA
SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA DE COOMBS
DIRECTA
• La concentración de IgG sobre GR para producir una
reacción positiva es variable, pero se establece que
puede existir entre 120 a 500 moléculas de IgG para dar
un Coombs positivo.
COOMBS Mol IgG/GR
Negativo 25-120
+/- 120
1+ 200
2+ 300-500
3+ 4+ 500
Significado del Coombs Directo positivo
• Una prueba de Coombs directa anormal (positiva)
significa que usted tiene anticuerpos que actúan contra
sus glóbulos rojos, lo cual puede deberse a:
• Anemia hemolítica autoinmunitaria
• Leucemia linfocítica crónica u otro trastorno similar
• Anemia hemolítica inducida por fármacos
• Eritroblastosis fetal (enfermedad hemolítica del recién
nacido)
• Mononucleosis infecciosa
Significado del Coombs Directo positivo
• Infección por micoplasma
• Sífilis
• Lupus eritematoso sistémico u otra afección
reumatológica
• Reacción a transfusión como la ocasionada por unidades
de sangre cotejadas de manera impropia
• Esta prueba también puede ser anormal sin una causa
clara, especialmente entre los ancianos.
Significado del Coombs Directo positivo
• Es necesario tener en cuenta que a veces el test de
Coombs directo puede ser positivo sin que exista
hemólisis, como se puede documentar en 0,01-0,1% de
los donantes de sangre.
• Por el contrario, existen casos de AHAI en los que la
prueba de Coombs directa a es negativa debido a la
existencia de IgG en lamembrana del hematíe en
cantidades insuficientes para ser detectadas por el test
Significado del Coombs Directo positivo
SIGNIFICADO DEL COOMBS
DIRECTO POSITIVO
Significado del Coombs Directo positivo
Significado del Coombs Directo positivo
SIGNIFICADO DE LA P.A.D.
POSITIVA
1. Autoanticuerpos
contra antígenos
eritrocitarios
2. Aloanticuerpos del
receptor, que
reaccionan con los
Ags. Eritrocitarios
transfundidos.
SIGNIFICADO DE LA P.A.D.
POSITIVA
3. Aloanticuerpos del
plasma, que
reaccionan con
Ags. Del receptor.
4. Aloanticuerpos
maternos, que
atraviesan la
placenta y
recubren lo G.R.
fetales
SIGNIFICADO DE LA P.A.D.
POSITIVA
5. Anticuerpos
dirigidos contra
ciertas drogas,
que se fijan a la
membrana del
G.R. (penicilina)
SIGNIFICADO DE LA P.A.D.
POSITIVA
6. Proteínas
adsorbidas,
(inmunoglobulinas)
que se fijan a las
membranas
alteradas o G.R.
modificados por
algunas drogas
(cefalosporinas 1a)
SIGNIFICADO DE LA P.A.D.
POSITIVA
7. Componentes del
complemento o
algunas IgG, fijadas
a los G.R. post-
administración de
fármacos (Quinidina
y Fenacetina), que
inducen interacción
droga/antidrogas.
Glóbulos Rojos con PAD Positiva
Principios:
• GR. Recubiertos con IgG pueden
aglutinarse con reactivos
hiperproteicos y provocar
resultados “falsos positivos”
Métodos Especiales en IH
• Disociación/Elución (sin afectar los GR)
• Adsorción
• Auto-adsorción
• Elución (para estudio de Acs.)
Disociación
• Disociación / Elución:
• Conservar los hematíes para estudiarlos y descartar los
anticuerpos
• Ej: Estudiar ag. en GR CD (+).
Disociación por Calor
• Disociación o Elución por Calor:
• 1 volumen de GR - PAD+ lavar 3V/SS
• 1Volumen de Paquete GR. + 3 volúmenes de SS.
• Incubar a 45ºC de 10 – 15 min. Agitando.
• Centrifugar y descartar sobrenadante.
• Evaluar con CD:
– CD+: repetir procedimiento
– CD- : Evaluar Ags.
Disociación
Difosfato de Cloroquina
• Gamma-Quin
• Disphosphato de
Cloroquina (DFC)
• Permite la
disociación de los
anticuerpos
adheridos a los GR
Disociación
Difosfato de Cloroquina
– Es una solución iso-osmótica (300 ±20 mOsm), a pH 7
– El complejo ag-ac es fracturado por el difosfatode cloroquina
– Mantiene intacta la membrana-Permite la determinación de:
– Antigenos (hemoclasificación).
– Autoadsorción.
– No siempre disocia (puede variar en el mismo Ac)
Disociación
Difosfato de Cloroquina
TECNICA:
• GR lavados 3X
• Colocar 0.5 mL de GR (1 GR x 4 de DFC)
• Añadir 2 mL de DFC
• Incubar a T° ambiente Hasta 2 horas (1hora)
• Lavar 3 veces y controlar: CD
Disociación
EDTA Glicina - Acida
• La capacidad de disociar inmunoglobulina de los glóbulos rojos
sin dañar la reactividad de los antígenos de superficie es de
un gran valor al permitir que los glóbulos rojo se clasifiquen.
• Técnica ideal para el tratamiento de G.R. revestidos de
inmunoglobulina (CD+), como en la AHAI o EHRN,
Disociación
EDTA Glicina - Acida
Gamma EGA Gamma EGA
• Está indicado para su uso en la
disociación de IgG de los glóbulos rojos.
• El método de Acido Glicínico EDTA
es el procedimiento a elegir para la
clasificación de glóbulos rojos revestidos
de aloanticuerpos o autoanticuerpos IgG
reactivos al calor.
Burin des Roziers N, Squalli S. Eliminación de
anticuerpos IgG de glóbulos rojos intactos:
comparación de métodos de ácido y EDTA, calor, y
elución de cloroquina. Transfusion 1997; 37:497-501.
Disociación
EDTA Glicina - Acida
TECNICA:
• GR lavados 3X y Susp. 2-3ml de el 3% – 5%
• Colocar 1.5 mL de Susp. GR. Centrifugar y descartar S/bte.
• Añadir sol.de EDTA+ Acido Glicínico.
• Incubar a T° ambiente Hasta 2 min.
• Centrifugar y Lavar 3 veces con SS-
• Realizar CD.
EDTA Glicina - Acida
• El tratamiento de glóbulos rojos mediante este
procedimiento hace que los glóbulos rojos sean
incapaces de ser clasificados para antígenos del sistema
Kell.
• Los únicos antígenos que se ha demostrado que no se
desnaturalizan mediante el tratamiento son: M, N, S, s,
D, C, E, c, e, Fya, Fyb, Jka y Jkb.
Adsorción
• Conceptos
• Adsorción de anticuerpos Fijar anticuerpos a su respectivo antígeno
hemático
• Ej:
– Eliminar autoanticuerpos.
– investigar Ag débiles.
– separar mx de Acs.
Adsorción - Selectiva
- Mezcla de aloanticuerpos
- GR. Ags. Conocidos.
- Suero Absorbido: IAI
- Eluado GR: IAI
Adsorción Autóloga:
– Finalidad: eliminar el Autoanticuerpo y luego detectar
aloanticuerpos.
– Válido: si no fue TF recientemente (3 meses)
– Preparar previamente los GR (elución) Calor: 45-50°C por
10 a 15 min.
Adsorción Autóloga Polietilenglicol
– El polietilenglicol (PEG) aumenta la
adsorción de Acs. Por GR. No
tratados.
– Este método puede utilizarse para
la adsorción autóloga y alogénica
(ABO compatible de fenotipo
conocido).
Adsorción Autóloga Polietilenglicol
(PEG)
Gamma PeG Gamma PeG
• Está indicado como un
aditivo para mejorar la
sensibilidad en la detección
de anticuerpos y crea un
entorno de prueba de
baja fuerza iónica que
aumenta la tasa de
absorción de anticuerpos
durante la incubación.
Autoabsorción PEG en caliente 37ºC
Adsorción Autóloga Polietilenglicol (PEG)
– Reactividad del suero (1+): 1 adsorción
– Reactividad de (2+y3+): 2 a 3 adsorciones
– Para evaluar el suero absorbido utilizar el
doble de muestra, para ajustar la dilución
del suero con PEG.
– Se debe evaluar el suero absorbido el
mismo día.
Adsorción Autóloga
ZZAP
• Reduce las uniones disulfuro (-S-S-)
mediante un H+ (-SH, HS-)
• Subunidades IgM se separan de la
cadena "J“ y pierden su actividad.
• DTT y 2-ME inactiva los antigenos Jsay
Jsb
• DTT inactiva todos antígenos del
sistema Kell(excepto Kx), Kna, Yta,
JMH
Adsorción Autóloga
ZZAP
W.A.R.M W.A.R.M
• Warm Autoantibody Removal
Medium :
• es una solución de sulfidril/enzima
diseñada para la disociación de IgG de
los glóbulos rojos para el
procedimiento de autoadsorción en
caliente.
• El reactivo se base en el reactivo ZZAP
descrito por Branch y Petz
Adsorción Homóloga
Condiciones:
• Paciente severamente anémico.
• Transfundido recientemente.
• Si fracasa la Autoabsorción.
• Debe usarse GR de fenotipo igual
al del paciente
Adsorción Homóloga
Condiciones:
• GR isogrupo con el paciente
1. R1R1 (DCe) K- Jka-
2. R2R2 (DEc) K- Jkb-
3. rr (dce) K-
• Tratados con enzimas*
Adsorción Homóloga
Condiciones:
• Si no asegurarse que los Ag
Fya, Fyb y S estén ausentes en
al menos una de los tres GR.
Elución
• Elución: Obtener los anticuerpos para identificarlos y
descartar los hematíes.
• Daño irreversible de la membrana eritrocitaria.
• Ej. Investigar una RHPTr, EHFRN.
Eluado Eritrocitos destruidos
TECNICAS DE ELUCION
• no existe una tecnica de elucion que permita obtener la
maxima cantidad de anticuerpos en todos los casos.
• ELUCION POR CALOR.
• ELUCION POR ETER.
• ELUCION POR CLOROFORMO
• ELUCION ACIDA.
Glicina ácida
• Eluye los Ac. adheridos a los GR
• Daña irreversiblemente la membrana
• Hay un exceso de H+ y reemplaza a los puentes de H+
• Se neutraliza por la adición de un buffer
Glicina ácida
1. Identificar anticuerpos revistiendo glóbulos
rojos de pacientes que presentan una prueba
de antiglobulina directa positiva.
2. Para aislar anticuerpos específicos a partir de
suero que contenga múltiples especificidades
mediante la absorción in Vitro de glóbulos
rojos seleccionados.
3. Para determinar la presencia de antígenos
débilmente expresados en glóbulos rojos tras
una incubación anterior con antisuero
seleccionado.
Glicina ácida
Gamma ELU-KIT II Gamma ELU-KIT II
• Los glóbulos rojos lavados
posteriormente se suspenden en una
solución de glicina con un pH bajo para
disociar el anticuerpo vinculado.
• Tras la centrifugación, el sobrenadante
que contiene todo anticuerpo
disociado se separa de los glóbulos
rojos y se neutraliza empleando un
solución tamponada.
Glicina ácida
Gamma ELU-KIT II Gamma ELU-KIT II
• El eluato posteriormente se
encuentra preparado para la
prueba de detección de
anticuerpos y/o identificación.
• Se debe realizar la prueba a una
muestra del lavado final en
busca de actividad de
anticuerpos en paralelo con el
eluato.
!Muchas Gracias por su atención¡
“LA TRANSFUSIÒN NO DEBE
NEGARSE A NINGÙN PACIENTE CON
UNA NECESIDAD JUSTIFICABLE,
AUNQUE SEA IMPOSIBLE
ENCONTRAR SANGRE COMPATIBLE”
Lawrence D.Petz,MD.American Society of
Hematology. Edutational Program Book.
Philadelphia,Pen,Dec.6 10,2002
