TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Enzo Paolo Díaz Conde
Laboratorio de Citogenética «Luis Alberto Tellería Cáceres»
26 de junio del 2019
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INDICE
1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 2
¿QUÉ ES EL ADN RECOMBINANTE?
La tecnología de ADN recombinante es el
conjunto técnicas moleculares para localizar,
aislar, alterar, analizar y recombinar secuencias
del ADN. Las células y organismos que reciben
estas combinaciones genéticas reciben el
nombre de ORGANISMOS TRANSGÉNICOS.
Las primeras moléculas de ADN
recombinante (ADNr) fueron generadas en
1973 por Paul Berg, Herbert Boyer, Annie
Chang y Stanley Cohen de la Universidad de
Stanford y la Universidad de California en San
Francisco.
“The Paul Berg Papers: All Visuals”, s/f Pham, 2018
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 3
La tecnología de ADN
recombinante se
relaciona con el uso de
tres herramientas
principales: (1) enzimas
(enzimas de restricción,
polimerasas y ligasas); (2)
vectores; y (3)
organismos huésped.
Cohen, 2013
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 4
INGENIERÍA GENÉTICA
ENZIMA DE RESTRICCIÓN TÉCNICAS
Capaces de cortar al ADN en BIOTECNOLÓGICAS
Se obtiene
ciertos puntos • Recombinación del ADN.
• Secuenciación del ADN.
• Reacción en cadena de la
polimerasa
ADN RECOMBINANTE
Segmento de ADN foráneo
intercalado en un ADN receptor.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 5
TÉCNICAS EMPLEADAS EN LA TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
• ROTURA ESPECÍFICA DEL ADN, por endonucleasas de restricción.
• SECUENCIACION RÁPIDA, de los nucleótidos de un fragmento de ADN
aislado.
• HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS, que posibilita localizar secuencias
determinadas de ADN o ARN.
• CLONACIÓN DE ADN, para conseguir que un fragmento de ADN se integre
en un elemento génico autorreplicable para generar miles de copias
idénticas.
• INGENIERÍA GENÉTICA, para alterar secuencias de ADN y producir
versiones modificadas de los genes.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 6
PIONEROS DE LA INGENIERÍA GENÉTICA
Stanley Cohen (plásmidos) y Herbert Boyer
(enzimas de restricción).
• Experimentaron para seleccionar,
recombinar y transformar nuevos genes
en bacterias.
• Sus técnicas aún son usadas en
laboratorios de Biología Molecular.
• Uno de los más importantes
descubrimientos en la investigación
biomédica.
• En 1978, Genentech logra sintetizar
somatostatina y más adelante la
insulina humana.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 7
INDICE
1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 8
EcoRV actuando sobre una
secuencia de ADN
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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
• Enzimas de origen bacteriano que tras su unión a una
secuencia diana en el ADN cortan ambas cadenas según un
patrón de corte característico.
• Defienden a las bacterias del ingreso de ADN extraño.
• Se conocen tres tipos de endonucleasas de restricción, según la
secuencia diana, el tipo de corte en el ADN, requerimientos
físico - químicos y la estructura de la enzima: I, II Y III.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 10
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
Enzimas de restricción comunes, con su secuencia de reconocimiento, patrones de
corte de ADN y orígenes. Las flechas indican la ubicación del corte en el ADN por
cada enzima. Klug, 2012
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 11
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
ACCIÓN DE ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
P
A
L
Í
N
D
R
O
M
O
S
Reconocen secuencias palindrómicas
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 12
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
TIPO I Y TIPO III
Tienen actividad de restricción y modificación.
Reconocen una secuencia específica.
Recorren un cierto número de bases y cortan.
Precisan Mg2+ como cofactor, S—adenosil-metionina y ATP para moverse
desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte
TIPO II
Solo tienen actividad de restricción dentro de la secuencia de
reconocimiento
Precisan Mg2+ como cofactor, pero no ATP
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 13
El ADN de diferentes fuentes se rompe con EcoRi y se mezcla para permitir la hibridaación.
La enzima ADN ligasa forma enlaces fosfodiéster entre estos fragmentos para crear una
molécula de ADN recombinante intacta. Klug, 2012
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ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
VISUALIZACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE ADN TRAS LA DIGESTIÓN
Los fragmentos deben ser sometidos a una
electroforesis en gel de agarosa.
Esta técnica permite la separación de
moléculas según su tamaño y carga eléctrica.
El ADN es una molécula cargada
negativamente por lo que migrará hacia el
ánodo.
Un plásmido tratado con 2
endonucleasas de restricción
diferentes produce fragmentos
distintos con cada una.
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INDICE
1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
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CLONACIÓN
La molécula de ADN recombinante debe
ser introducida en un huésped donde se
replicará y producirá numerosas copias
idénticas o clones.
Para ello deben emplearse vehículos
especializados: los vectores de clonación
molecular, moléculas de ADN a las que
puede unirse un fragmento de ADN
extraño para introducirse en una célula. . .
¡donde se replicará en miles de copias!
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 17
VECTORES DE CLONACIÓN
Presenta las siguientes características:
1. Capacidad para replicarse de manera autónoma dentro de
la célula huésped (ORI+).
2. Poseen un marcador seleccionable (gen de resistencia a
antibióticos).
3. Uno o más sitios de restricción únicos (para la inserción de
ADN foráneo).
Vectores disponibles:
• Plásmidos.
• Bacteriófagos.
• Cósmidos.
• Cromosomas artificiales.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 18
VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS
• Moléculas circulares extracromosómicas
de ADN bicatenario.
• Tamaño de 1 kb a más de 200 kb.
• Inconveniente: Solo pueden incorporar
ADN de pocas kilobases. (> 15 kb =
inestabilidad)
• Poseen origen de replicación propio.
• Genes para la resistencia a antibióticos
(ampicilina, tetraciclina). Permiten
reconocer bacterias transformadas.
• Dianas para enzimas de restricción únicas.
ARRIBA. Una micrografía electrónica de color
realzado de moléculas de plásmidos circulares
aisladas de E. coli.
ABAJO. Diagrama de un plásmido de clonación
de ADN típico.
Klug, 2012 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 19
VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS
Klug, 2012 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 20
VECTORES DE CLONACIÓN: BACTERIÓFAGOS
VIRUS: Se emplea como vector
junto con la capacidad que
poseen para introducir ADN
foráneo en la célula
hospedadora.
• Para bacterias: Fago λ, fago
M13
• Para células de plantas:
CaMV
• Para células de mamíferos:
El Fago λ presenta el ADN
flanqueado por secuencias cos.
Dentro del fago es lineal pero
en el citoplasma de E. coli
adopta una forma circular.
Pueden aceptar desde 5 kb
(por inserción) hasta 20 kb (de
reemplazamiento)
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 21
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 22
VECTORES DE CLONACIÓN: CÓSMIDOS
Por clonación de
fragmentos de ADN de
hasta 50 kb junto a
secuencias cos del
Fago λ. Son una
mezcla de plásmido y
virus. Pueden
empaquetarse para
tener capacidad
infectiva e ingresar el
material genético en
la célula huésped.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 23
VECTORES DE CLONACIÓN: CROMOSOMAS
ARTIFICIALES
• Permiten clonar fragmentos de ADN
de unas cuantas megabases.
• Existen los cromosomas artificiales de
levadura YAC (yeast artificial
chromosome) y los cromosomas
artificiales bacterianos BAC (bacterial
artificial chromosome).
Los YAC contienen los siguientes
elementos:
• Dos telómeros. Un centrómero..
• Un origen de replicación.
• Marcador de selección
• Dianas de restricción.
[Link] TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 24
VECTORES DE EXPRESIÓN
• Permiten la obtención del producto
proteico del gen clonado (ejm:
insulina).
• Disponen de un promotor muy
activo y a veces regulable.
• Los vectores pET se usan para
expresar genes eucarióticos en E.
coli.
• El promotor T7 debe estar unido a
la T7 ARN polimerasa (codificada
en el genoma del huésped) para
conducir la expresión del gen
insertado pero se encuentra
suprimido por el represor lac.
• Si agregamos
isopropiltiogalactósido (IPTG) al
medio de cultivo se desplazará al
represor lac y se transcribirá el gen
clonado .
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INDICE
1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
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HOSPEDADORES. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR –
ADN FORÁNEO
Las cepas de E. coli poseen las siguientes
características ideales:
• No son patogénicas.
• Son viables solo en el laboratorio.
• Solo son operativas para una función deseada.
Cuando el vector es un plásmido, la incorporación
de ADN se denomina TRANSFORMACIÓN. Esta
puede darse por tratamiento con cloruro cálcico y
breves tratamientos con electroshock.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 27
HOSPEDADORES. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR –
ADN FORÁNEO
TRANSDUCCIÓN. El ADN bacteriano es transmitido de una célula a otra
por medio de un bacteriófago.
Puede ser:
• Generalizada. Capaz de
transmitir cualquier parte
del cromosoma
bacteriano. La cantidad
de ADN depende del
tamaño de la cápside.
• Especializada. Transporta
solo porciones específicas
del cromosoma
bacteriano. Por errores
durante el ciclo vital
lisogénico.
[Link]
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1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 29
MÉTODOS DE SELECCIÓN
• RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS.
• GENES MARCADORES (GEN β – GALACTOSIDASA)
• GFP (GREEN FLUORESCENT PROTEIN)
• HIBRIDACIÓN DE COLONIAS
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 30
MÉTODOS DE SELECCIÓN: Resistencia a
antibióticos y β-galactosidasa
Alfa complementación.
A. El plásmido produce un
péptido capaz de
complementar la
proteína producida por
el gen LacZ ∆ M15 y así
obtener una β-
galactosidasa funcional.
B. Resultado de la
transformación: las
bacterias que no han
aceptado el plásmido no
forman colonias en un
medio con antibiótico
mientras que las que
portan el plásmido
sobreviven y producen
colonias azules o
blancas según dispongan
de β-galactosidasa
funcional o no.
Benito & Espino, 2012 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 31
MÉTODOS DE SELECCIÓN: GFP
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 32
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1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
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GENOTECAS
DEFINICIÓN
Colección de clones que contiene todo el
genoma de un organismo.
TIPOS DE GENOTECAS:
• Genómicas.
• Parciales.
• ADNc. Colección de ARNm.
• Genotecas de expresión.
TIPOS DE VECTORES:
• Plásmidos (genotecas parciales)
• Fagos (genotecas genómicas pequeñas y
de ADNc)
• Cósmidos, BAC (genotecas genómicas
complejas)
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 34
GENOTECAS
Benito & Espino, 2012 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 35
GENOTECAS
Benito & Espino, 2012 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 36
GENOTECAS: OBTENCIÓN DE ADNc
Produciendo ADNc desde ARNm. Debido a
que la mayoría de los ARNm eucarióticos
tienen una cola poli-A en el extremo 3´,
una molécula de oligo (dt) corta recocida
en esta cola sirve como cebador para la
enzima transcriptasa inversa. La
transcriptasa inversa utiliza el ARNm como
plantilla para sintetizar una cadena de ADN
complementaria (ADNc) y forma un dúplex
de doble cadena ARNm/ADNc. El ARNm se
digiere con la enzima ARNasa, produciendo
huecos en la hebra de ARN. Los extremos
del ARN restante sirven como cebadores
para la ADN polimerasa I, que sintetiza una
segunda cadena de ADN. El resultado es
una molécula de ADNc de doble cadena
que puede clonarse en un vector
adecuado.
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1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 38
GENOTECAS: HIBRIDACIÓN CON SONDA DE ADN
La operación de identificar un gen en
las genotecas se denomina cribado.
Dos cadenas de ADN o ARN pueden
unirse por puentes de hidrógeno
entre las bases C – G y A – T (o A- U, si
fuese ARN)
Se puede utilizar una sonda marcada
para detectar la hibridación entre
esta y su ADN o ARN complementario.
Algunas usan átomos radioactivos o
nucleótidos unidos a moléculas como
la digoxigenina que se pueden
identificar mediante una reacción
química.
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1. Conceptos básicos de la tecnología del ADN recombinante.
2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 40
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Replicación del ADN
por la ADN
polimerasa.
Solo se necesita
saber la secuencia
de nucleótidos de
dos extremos del
fragmento de ADN
que se desea copiar
(cebadores).
Se compone de 3
pasos:
1. Denaturalización
del ADN.
2. Emparejamiento
de los cebadores.
3. Síntesis de ADN.
La polimerasa que se
usa es la Taq
polimerasa, resiste
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
temperaturas de 4170-
72º C.
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2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
[Link].
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SECUENCIACIÓN
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MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR PCR
Heckman & Pease, 2007
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2. Aislamiento de ADN foráneo. Endonucleasas.
3. Vectores de clonación y unión del fragmento de ADN.
4. Hospedadores. Introducción del vector – ADN foráneo.
5. Métodos de selección.
6. Genotecas.
7. Hibridación de ácidos nucleicos.
8. PCR.
9. Secuenciación.
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APLICACIONES: PRODUCCIÓN DE INSULINA
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APLICACIONES: PLANTAS TRANSGÉNICAS
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APLICACIONES: CLONACIÓN DE ANIMALES.
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APLICACIONES: CLONACIÓN DE ANIMALES.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 50
APLICACIONES: CLONACIÓN TERAPÉUTICA
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Muchas gracias por su atención.
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE 52
