INMUNOSEROLOGÍA
INMUNODIAGNÓSTICO
Es una metodología de diagnóstico que utiliza
un antígeno-anticuerpo, reacción como su principal
medio de detección.
Antígeno
Es una sustancia que desencadena la formación de
anticuerpos y puede causar una respuesta inmunitaria.
Abarca todas las sustancias que pueden ser
reconocidas por el sistema inmunitario adaptativo, bien
sean propias o ajenas.
Un antígeno suele ser una molécula ajena o tóxica para
el organismo (por ejemplo, una proteína derivada de
una bacteria) que, una vez dentro del cuerpo, atrae y se
une con alta afinidad a un anticuerpo específico.
INMUNODIAGNÓSTICO
Anticuerpo: sustancia de naturaleza glucoproteica
denominada inmunoglobulina (Ig) que es producida como
respuesta del sistema inmunitario ante la presencia de una
sustancia extraña llamada antígeno. Cada anticuerpo se
fabrica expresamente para un determinado antígeno con tal
grado de especificidad.
Diagnóstico serológico
1.- Aglutinación:
- Ag particulado
- Reacción macroscópica
TIPOS:
- Directo
- Indirecto
- Aglutinación reversa
- Inhibición de la glutinación
Diagnóstico serológico
2.- Precipitación:
Precipitación en fase líquida.- Se
lleva a cabo en un medio líquido
Precipitación en fase sólida
(inmunodifusión).- Se lleva a cabo
sobre un soporte de agar-agar donde
se colocan al antígeno y anticuerpo
ambos migran en todas direcciones
formando en su lugar de encuentro
bandas de precipitación
Inmunofisión simple
Inmunodifusión doble
Microfloculación
INMUNODIFUSIÓN
La inmunodifusión es una técnica de análisis
inmunológico de tipo cualitativo y cuantitativo. Se
utiliza para detectar la cantidad de anticuerpos IgG,
IgM e IgA que hay en el suero de un individuo.
Se utiliza como soporte un gel de poliacrialmida o
agar noble para que los antígenos y anticuerpos
puedan desplazarse y luego verificar esta reacción a
través de las bandas de precipitación que se
forman.
INMUNOFLUORESCENCIA
Diagnóstico serológico:
[Link]
Basada en el uso de anticuerpos
marcados con sustancias
fluorescentes-conjugado
(isotiocianato de fluoresceina, Tetra-
metil rodamina, Auramina O) que se
unen al antígeno en investigación. Es
necesario el uso de microscopio de
inmunofluorescencia (UV)
1. Inmunofluorescencia Directa:
Anticuerpo marcado + antígeno
2. Inmunofluorescencia Indirecta: Anti-
anticuerpo marcado + (anticuerpo +
antígeno)
ELISA
La prueba de ELISA se basa en la reacción
antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser
de reactividad conocida.
El color se genera por la interacción de un
sustrato cromogénico y una enzima que ha sido
acoplada al anticuerpo detector.
Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el
antígeno en la fase sólida, como una capa de
captura.
Después de la reacción del antígeno con el suero
del paciente, la capa de detección puede ser un
reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM
o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos
clase específicos
ELISA
Los métodos de ELISA dependiendo
de la actividad enzimática se
dividen en dos tipos:
Competitivos
No competitivos
ELISA
ELISA COMPETITIVO:
En este método, el anticuerpo de la
muestra va a competir con el conjugado
por un número limitado de sitios de unión
del antígeno. Habrá ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el
sustrato no encontrará a la enzima
porque el conjugado ha sido desplazado
por el anticuerpo presente en la muestra.
ELISA
ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra
con el antígeno o anticuerpo que
está en la fase sólida. Si una
muestra es positiva se formará el
complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionará
con el respectivo sustrato
desarrollando color.
ELISA
Dentro de los no competitivos
tenemos:
Los directos que detectan
antígenos
Los indirectos que detectan
anticuerpos.
ELISA
Pasos generales de un ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos
o anticuerpos
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o
antígeno tapizado en el posillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o
antígeno no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no
unida
8. Adición del sustrato
9. Unión del sustrato a la enzima
10. Desarrollo del color
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (2)
ELISA Competitiva (3)
ELISA Competitiva (4)
ELISA Competitiva (5)
ELISA Competitiva (6)
ELISA Competitiva (7)
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (9)
ELISA Competitiva (10)
Ejemplos
Dengue Virus
Es un virus de ARN de cadena
simple con un diámetro de 50 nm.
Pertenece a la familia de los
Flaviviridae
Se distinguen cuatro grupos
serológicos:
DEN- 1
DEN-2
DEN-3
DEN-4
DENGUE...
La infección con un serotipo no
produce inmunidad para los otros.
El Aedes aegypti constituye el
principal vector del dengue.
Dengue...
Imágenes clínicas:
Periodo de incubación de 1 a 2
semanas con escalofríos.
Dolores de cabeza
Dolores de miembros y músculos.
Dengue...
Dengue hemorrágico:
Petequias
Fuertes hemorragias nasales
Vómito de sangre
Melena
Hematuria
La agravación de la enfermedad deriva
en el Síndrome de Shock.
Utilización de la prueba
El inmunoensayo se utiliza para la
determinación cualitativa y
semicualitativa de anticuerpos IgG
específicos contra Dengue- Virus en
suero o plasma humano.
Principio del Ensayo
Las tiras de micropocillos (fase
sólida) están recubiertas con
antígenos específicos del Dengue-
Virus.
Los anticuerpos presentes en la
muestra se unen a los antígenos
inmobilizados en la placa.
Principio...
El conjugado de anticuerpos IgG
anti humano con peroxidasa del
rábano, se une a los complejos
antígeno anticuerpo en muestras
positivas.
Después de incubarse, los
complejos muestran una coloración
azul, al incubarlos con TMB.
Principio...
Finalmente, se añade ácido sulfúrico
para detener la reacción ( azul -
amarillo); la densidad se mide con un
lector de ELISA a 450 nm.
Procedimiento
Repartición y Posición de las
muestras.
Se Gradúa la incubadora a 37+1 °C.
Se pipetean 100 ul de controles y
muestras en los pocillos respectivos.
Se recubren las tiras con los
autoadhesivos.
Se incuba 1h + 5 min.
Después de incubar, se retira el
autoadhesivo y se realiza el lavado.
Procedimiento...
Pipetea 100 ul del conjugado anti IgG.
Se incuba 30 min a temperatura
ambiente.
Repetir el lavado.
Se pipetea 100 ul de sustrato de TMB.
Incuba 15 min en oscuridad a
temperatura ambiente.
Se añade la solución de parada
Se mide la extinción de la solución con
450/620nm por 30 min.
ETI- LKM1 y ETI mitocondrial
Permite la determiación cualitativa
de autoanticuerpos dirigidos contra
el citocromo P450 (LKM1) y las
enzimas mitocondriales (M2A/M2C)
en suero humano.
Principio del Ensayo
Los pocillos de la microplaca se
recubren con los antígenos.
Al añadir las muestras, , el anticuerpo
se une a los pocillos recubiertos.
En estos se incub IgG conjugada con
la enzima peroxidasa del rábano
contra IgG humano.
Se añada cromógeno y se lee con el
espectrofotómetro.
¡MUCHAS GRACIAS!
