Moderador

2014-02-05 14:42:32
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INTRODUCCIÓN AL CULTIVO C U
L
E
R
A
LABORATORIO NECESARIO P R
A
TRABAJAR CON CULTIVOS
CELULARES

INTRODUCCIÓN AL CULTIVO
ESTERILIZACIÓN,
PREPARACIÓN DEL
MATERIAL
RUTINAS EN CULTIVOS C E
U
L
A
RE
S
:

CELULAR
BUENOS HÁBITOS
CONTAMINACIONES Y SU
DETECCIÓN
Cultivo celular: Es un modelo de estudio in
vitro constituido por células que pueden
crecer y mantenerse en suspensión o en
monocapa por más de 24 horas en
condiciones controladas.
Cultivo celular: Obtención

• Los cultivos celulares pueden ser obtenidos a

partir de explantes de biopsias (fragmento
escindido desde un órgano o tejido), por
perfusión de un órgano específico, por
disgregación de tejidos o a partir de fluidos
orgánicos como la sangre.
 Moderador
2014-02-05 14:42:34
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Cultivo Primario: Se define como
aquelque se origina directamente a
partir de células, tejido u órgano
de un animal. El cultivo primario
es la mejor aproximación a un
organismo vivo. Este puede

Cultivo celular
preservar las funciones de un
órgano o tejido puesto que
posee la capacidad de
diferenciarse. El cultivo Primario
es considerado como tal hasta el
primer subcultivo. Línea Celular:

• Existen dos categorías de cultivo celular:

Surge a partir del primer replique
o pasaje de un cultivo primario.

Cultivo Primario

Línea Celular
 Moderador
2014-02-05 14:42:34
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aneuploidía hace referencia a c a
mb
io
sen
el número de cromosomas
PASE: Transferir un pequeño
número de células a un nuevo
continente.

Diferencias entre Cultivos Primarios y

Diferencia entre línea celular y cél.
Inmortalizadas. Línea celular
varios pases y inmortalizadas

Cultivo de Líneas celulares

pases indefinidos.
Obtención y establecimiento de Líneas
celulares
• Una línea celular queda establecida cuando se
demuestra su potencialidad de replicarse
indefinidamente.
• Las líneas celulares poseen propiedades conferidas
por diferencias en la dotación cromosómica
(aneuploidía) mutación o transformación genética
que deben persistir entre sucesivos pasajes o
subcultivos.
• Las líneas o cepas celulares con alguna característica
puntual pueden ser seleccionadas específicamente
mediante clonación.
Cultivo celular ¿qué necesitamos?
• 1- Formación de personal
• 2- Dinero
• 3- Instalaciones adecuadas
• 4- Estudio de las células a utilizar
• 5- Preparación de material y medios
• 6- Obtención de tejidos
• 7- Realización del cultivo
• 8- Caracterización del cultivo (crecimiento, forma)
• 9- Implante y congelación
 Moderador
2014-02-05 14:42:34
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- Virología: establecimiento de condicones
de cultivo de virus animales y de
plantas, producción de vacunas
antivirales,...
- Inmunología
- Ingeniería de proteínas. Por la produción

Uso de los cultivos

de proteínas en líneas celulares:
interferón, insulina, hormona de
crecimiento.
- Estudios de interacción y señalización
celular, en la diferenciación y en
el desarrollo.

• 1- Estudio virológicos
- Aplicaciones diagnósticas. Por
e
jmp
loen medicina y farmacología
destacan el análisis

• 2- Producción de vacunas
cromosómico de células
crecidas a partir de muestras de
amniocentesis, detección de

• 3- Ingeniería de proteínas infecciones virales, ensayos de

toxicidad,...
- Aplicaciones médicas: ma n
teim
ie
n
toy

• 4- Estudios de interacción/señalización celular

producción de tejido para
transplantes.
- Aplicaciones industriales y a g
ro
n
ó
mic
a
:
s

• 5- Producción para transplantes

producción pro reproducción "in
vitro" de clones de plantas de
interés comercial.

• 6- Reproducción “in vitro” de plantas de interés comercial

• 7- Ensayo de nuevos medicamentos
• 8- Estudio de toxinas
 Moderador
2014-02-05 14:42:34
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Ventajas y desventajes de los cultivos
celulares
Los cultivos celulares tienen una

Uso de los cultivos

seriede ventajas innegables, pero al
mismo tiempo tienen
desventajas que hay que tener
en consideración. Como
ventajas podemos citar:
- Permiten un control preciso y fino

VENTAJAS: del medio ambiente. En un

cultivo se pueden controlar todos
los factores del medio: Físico-
1-Control del entorno y caracterización químicos (pH, temperatura,
presión osmótica, niveles de O2,
CO2, tensión superficial...), y

2-Economía fisiológicos (hormonas, factores

de crecimiento, densidad
celular,...)

3-Motivaciones éticas - Caracterización y h o

mo
g
e
nid
ade la
muestra. Las células en cultivo
de una línea celular, o de una
línea continua son homogéneas,
con morfología y composición
uniformes. Se pueden obtener

DESVENTAJAS: con facilidad un número elevado

de réplicas idénticas, con lo que
se supera el grave problema de

1Personal preparado heterogeneidad de las muestras

inherente asociado al uso de
animales de experimentación.
TÉCNICA SENSIBLE
2Desdiferenciación celular - Economía. Suponen una e
(CONTAMINACIONES)
uso de reactivos o drogas a
estudiar pues al realizarse en
m
n
o
c íaen el

3-Variabilidad genética volúmenes reducidos, y con un

acceso directo de las células a la
droga las concentraciones
requeridas son mucho más bajas
que en el animal completo.
- Motivaciones éticas. La investigación
biomédica supone el sacrificio
cada año de muchos miles de
animales de experimentación. El
Dificultades en la implantación de
cultivos en un organismo vivo
• Proliferación
• Diferenciarse en los tipos celulares deseados
• Sobrevivir en el receptor tras el implante
• Integrarse en el tejido circundante
• Funcionar apropiadamente durante toda la vida
del receptor
• No producir daño al receptor
LABORATORIO NECESARIO PARA
TRABAJAR CON CULTIVOS
CELULARES
UNIDAD DE CULTIVOS
• Es un centro altamente especializado; por ello
han de cumplirse ciertos requerimientos:

-FISICOS
-ORGANIZACIÓN
-MATERIAL
REQUERIMIENTOS FISICOS
• Acceso restringido a la unidad de cultivos
• Separación física
• Adecuado al trabajo a desarrollar
• Fácil acceso a otras zonas
• Cumplimiento con la legislación vigente
REQUERIMIENTOS DE ORGANIZACIÓN

Personal: altamente especializado y en continuo

reciclaje.

Protocolos: todos los protocolos deben estar accesibles

y redactados de una manera que cualquier
persona pueda entenderlos fácilmente.
REQUERIMIENTOS DE ORGANIZACIÓN
LIMPIEZA:

• Condiciones de extrema limpieza

• Protocolos de limpieza de suelos, paredes y área
• Cambio periódico de productos
• Material propio de limpieza en exclusividad
REQUERIMIENTOS ORGANIZACIÓN
PREPARACIÓN DE MEDIOS

• Tomar nota de los proveedores, medios, lotes,

caducidades, fechas, recepción,…..de todos los
productos
• Emplear medios lo más recientes posibles
• Controlar todos los pasos
• Rotular todo convenientemente
 Moderador
2014-02-05 14:42:35
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Campana de flujo laminar: Su función
es la de mantener un área libre

REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
de partículas, especialmente de
posibles contaminantes
(bacterias, levaduras,...) que
puedan acceder al cultivo. Esto
se consigue mediante un

CAMPANA DE FLUJO LAMINAR: dispositivo mecánico que fuerza

el paso del aire a través de un
filtro de gran superficie (filtro
HEPA) situado o bien en el techo
(flujo vertical) o en la pared
frontal (flujo horizontal).
: Los diferentes tipos de cabinas e d
flujo laminar se diseñan con
• De flujo vertical
diferentes propósitos :
a. Protección personal : protecióndel
personal de los posibles agentes
dañinos del interior de la cabina.
• De flujo horizontal
b. Protección del producto, e
cultivo que se encuentra en el
prime
x n
too

interior de la cabina de los

contaminantes exteriores o de la
• De doble flujo
contaminación cruzada con otros
productos o cultivos situados en
la misma cabina. c. Protección
medioambiental : evitar la salida
• Lámpara UV
al medio ambiente de productos
o agentes contaminantes.
 Moderador
2014-02-05 14:42:35
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Un incubador moderno dispone e d
:1. dispositivos de control de

REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
temperatura, con un termostato
de seguridad que
2. dispositivo de inyección de una
mezcla de aire y CO2, en la
proporción deseada, entre el 4 y
el 7 %. El CO2 de elevada

INCUBADOR DE CO2:
pureza se suministra en botellas
presurizadas, y se mezcla en el
dispositivo de inyección.

mantenimiento de la temperatura controlada en

3. dispositivo de control de la h m
ua
d
e
ambiente. Para mantener el
cultivo se requiere una humedad

una atmósfera con un porcentaje controlado de

ambiente elevada, a fin de
reducir la evaporación de agua
del medio de cultivo. En los

CO2 y una humedad elevada. incubadores menos sofisticados

esto se consigue mediante
bandejas de agua en el fondo del
incubador. Este recurso es
peligroso pues son una fuente
importante de contaminaciones
al convertirse a los pocos dias en
• Bombonas de CO2 caldos de cultivo. En los
instrumentos más modernos se
• Circuito general dispone de dispositivos que
• Bandeja de agua (Fuente de contaminación) controlan la humedad
atmosférica, inyectando agua
• Sistemas de inyección de agua estéril estéril y filtrada. 4. dispositivo de
recircularización de aire. Es
• Recircularización de aire importante una recirculación del
aire en el interior del incubador,
• Filtros HEPA a fin de homogeneizar la
temperatura en su interior. Si
además en el circuito de
circulación de aire se intercala
un filtro HEPA se consiguen
eliminar las posibles partículas
contaminantes, y se asegura la
esterilidad del ambiente.
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
BAÑOS TERMOSTATIZADOS:
todos los medios de cultivo y líquidos que entren en
contacto con las células deberán estar atemperados a
la temperatura óptima de crecimiento de las células.
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
INSTRUMENTOS ÓPTICOS DE OBSERVACIÓN;
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
INVERTIDO:
el control morfológico del cultivo se realiza mediante
el uso de un microscopio.
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
CENTRÍFUGAS:
harán falta para poder formar un pellet de células
en el fondo del tubo y poder eliminar el
sobrenadante y resuspender las células en el
medio deseado
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
OTROS INSTRUMENTOS :
contadores de células electrónicos ("cell counter"),
equipos de purificación de agua, balanzas, pH-metro,
pipeteadores automáticos, micropipetas…
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
MATERIAL FUNGIBLE:
frascos de cultivo, placas, pipetas de cristal, tubos falcon,
tubos eppendorf...
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
ALMACENAMIENTO:

• Frío eléctrico (4ºC, -20ºC, -80ºC)

• Nitrógeno Líquido
• Liofilización/Deshidratación
REQUERIMIENTOS DE MATERIAL
ESTERILIZACIÓN
• Con maquinaria apropiada y homologada
• Con protocolos actualizados
• Con personal especializado

AUTOCLAVES
Y OLLAS
RUTINAS EN CULTIVOS
CELULARES: BUENOS HÁBITOS
Rutinas en cultivos

LA EXPERIENCIA
ES
FUNDAMENTAL
Rutinas en cultivos
• APRENDER SOBRE EL CULTIVO EN
CONCRETO:

Morfología y ciclo celular

Forma y tiempos de digestión
Densidad de siembra
Selección de medios a emplear: suero
Cuando hacer y cambiar medios
Rutinas en cultivos
• DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

1 Luz ultravioleta siempre que no se trabaje.

2 Encender la campana al menos 10 min antes

de comenzar el trabajo.

3 Limpieza de zona de trabajo con etanol 70%

al inicio y al final.

4 Esterilizar todo lo que entre dentro de la

campana y rociar con etanol 70% por el
exterior
Rutinas en cultivos
• DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

5-Habilitar espacio suficiente para trabajar.

6-Dominar el campo de trabajo.

7 No pasar por encima de placas, botellas o

recipientes abiertos.

8Poner tapones boca arriba y hacia la parte

trasera de la campana para evitar pasar por
encima de ellos.
Rutinas en cultivos
• DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

9No tocar con las pipetas ni puntas

estériles ninguna superficie.

10Utilizar una pipeta o una punta cada

vez.

11Tener cuidado de que no se

produzcan contaminaciones cruzadas.
Rutinas en cultivos
DEL CULTIVO CELULAR

1No mezclar nunca dos cultivos diferentes.

2No tener mucho tiempo fuera de estufa los cultivos.

3-No invadir campos.

4 Tapar rápidamente los frascos.

5 Agitación del cultivo sembrado de dcha/izq y de

arriba/abajo. Nunca agitar en círculo.
 Moderador
2014-02-05 14:42:35
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Rutinas en cultivos
Estos problemas pueden afrontarse
mediante métodos de cultivo
celular en esterilidad. El objetivo
de estos métodos es evitar la
contaminación con bacterias o
levaduras que competirían con

• Manipulación de las células en cultivo

las células mamíferas por los
nutrientes y/o podrían infectar y
eliminar las células. Toda
manipulación se lleva a cabo,
típicamente, en una campana de
flujo laminar para evitar la

Las células están en continua división durante el

entrada de microorganismos
contaminantes. También pueden
añadirse antibióticos al medio de

cultivo, crecen hasta ocupar todo el área disponible.

cultivo. Entre las manipulaciones
más comunes llevadas a cabo

Esto puede generar varios problemas:

en cultivos celulares, se
encuentran los cambios de
medio, el pase de las células y la
transfección.

• Agotamiento de los nutrientes del medio

• Acumulación de células apoptóticas o necróticas

• Inhibición de la división celular por contacto

 Moderador
2014-02-05 14:42:36
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En el caso de las suspensiones celulares,
las células se separan del medio

Rutinas en cultivos
mediante centrifugación y se
resuspenden en medio fresco.
En los cultivos adherentes, el
medio puede eliminarse
directamente mediante
aspiración y reemplazarse por el
fresco.

• Cambios de medio

El objetivo de los cambios de medio es renovar

los nutrientes y evitar la acumulación de
productos metabólicos potencialmente tóxicos y
de células muertas.

 Cultivos en suspensión (centrifugación)

 Cultivos adherentes (aspiración)

 Moderador
2014-02-05 14:42:36
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Rutinas en cultivos
Con cultivos en suspensión el p a
e
s
se
hace fácilmente, tomando una
pequeña cantidad de cultivo que
contenga unas pocas células y
diluyéndola en un volumen

• Pase de las células mayor de medio fresco. En

cultivos adherentes, las células
han de ser inicialmente

Transferir un pequeño número de células a un nuevo despegadas; esto se efectúa

comúnmente con una mezcla de
tripsina y EDTA, aunque
continente. Las células pueden cultivarse más actualmente existen otras
mezclas de enzimas para esto.

tiempo si se pasan regularmente, ya que así se evita

Un pequeño número de las
células despegadas pueden
sembrarse en un nuevo

la senescencia asociada a situaciones prolongadas de continente.

alta densidad celular.

 Cultivos en suspensión (tomar unas pocas y resuspender en medio fresco)

 Cultivos adherentes (despegar y pasar)

Rutinas en cultivos
DEL MATERIAL, MEDIOS Y OTROS

1Controles periódicos

2El fungible de un único uso

3-Ante la duda desecharlo

4-Que sea fresco

Rutinas en cultivos
DEL MATERIAL, MEDIOS Y OTROS

5Atemperarlo antes de trabajar con él

6No emplear nunca el medio/producto sobrante

7-Desechos a contenedores específicos

8-Registrar todo por marcas/lotes/caducidades

Rutinas en cultivos
DEL MATERIAL, MEDIOS Y OTROS

9-Alicuotar todos los productos por “medidas a usar”

10-Usar cada tanda de trabajo una alícuota

11 No usar material caducado

12 Trabajar con productos con certificados de calidad

13 No quedarse sin material por parte del suministrador

MUCHAS GRACIAS