Enfermedad de Chagas
Diagnóstico de
Laboratorio
(HAI-IFI)
Alumna: Uriarte Saldaña Yovana
Enfermedad de Chagas
►Zoonosis que afecta a los mamíferos silvestres
y domésticos.
►Agente causal: parásito unicelular: Tripanosoma
cruzi.
►Agente transmisor: Triatoma, (chinches,
chinchones, chirimachas) insecto hematófago,
de hábitos nocturnos, que convive con el
hombre dentro y fuera de los domicilios.
Epidemiologia: América
ARGENTINA
Perú
Vías de transmisión del T.cruzi
• Vertical • Transplante de órgano
• Vectorial • Accidente de
laboratorio
• Transfusión • Oral (No demostrada en
nuestro país)
Enfermedad de Chagas
Fases de la Enfermedad de Chagas
Diagnóstico Clínico
• El diagnóstico etiológico de la enfermedad de Chagas se basa en la evaluación
clínica, epidemiología y pruebas de laboratorio. Para el diagnóstico de
laboratorio, los exámenes adecuados dependen de la fase clínica del paciente.
Métodos de Diagnóstico de Laboratorio
Parásitos Anticuerpos
Métodos Métodos
Parasitológicos Inmunoserológicos
Directos
Duplas serológicas
(*):
HAI-ELISA
HAI-IFI
ELISA-IFI
Sensibilidad: 98,5-99%
(*) En caso que el resultado fuera discordante, deberá realizarse una tercera técnica o derivar a un
Laboratorio de mayor complejidad.
HAI : Hemaglutinación Indirecta
HAI : Hemaglutinación Indirecta
FUNDMENTO:
La hemaglutinación indirecta
(HAI), también llamada
hemaglutinación reversa pasiva,
se basa en la propiedad que
tienen los anticuerpos (que en
este caso son anti-T. cruzi)
de producir aglutinación
específica en presencia de
glóbulos rojos sensibilizados con
los correspondientes antígenos.
FUENTE: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
HAI : Hemaglutinación Indirecta
La hemaglutinación indirecta emplea glóbulos rojos de carnero, previamente tratados con ácido
tánico, como soporte de extractos solubles del parásito (antígeno). Es una prueba altamente
sensible y específica.
• Los kits comerciales simplifican la ejecución de la técnica, proporcionando el antígeno
absorbido a los glóbulos rojos.
Toma de Muestra
Muestra: suero.
• Se debe obtener en forma aséptica.
• No usar anticoagulante.
• Dejar coagular la sangre en forma inclinada.
• No refrigerar hasta que el coagulo se haya retraído.
• Transportar en refrigeración.
• Almacenar el suero en congelación.
Materiales y Reactivos
• Placas de poliestireno con fondo en U.
• Micropipeta de 5 a 50 µL.
• Micropipeta multicanal de 5 a 50 µ.
• Puntas para micropipeta.
• Solución Alsever.
• Sangre de carnero.
• Suero fisiológico.
• Buffer fosfato salino pH 7,2.
• Buffer fosfato salino pH 6,4.
• Ácido tánico.
• Solución diluyente.
• Suero control positivo a Trypanosoma cruzi.
• Suero control negativo a Trypanosoma cruzi.
• Antígeno de Trypanosoma cruzi.
Procedimiento
• Rotular una placa de microtitulación para realizar diluciones de los sueros
a evaluar, incluyendo los sueros controles positivo y negativo. Iniciar en la
dilución ¼ hasta 1/512.
• Colocar en los pozos de la fila A, 75 uL de la solución diluyente y 50 uL en
los pozos de las filas B, C, D, E, F, G y H.
• Agregar a cada pozo de la fila A, 25 uL del suero a evaluar, homogeneizar
aspirando y expeliendo varias veces con la pipeta.
• Luego realizar diluciones sucesivas. Con la ayuda de una micropipeta
multicanal tomar 50 uL de la dilución ¼ de cada suero por evaluar y
verterlo en los pozos de la fila siguiente, homogeneizar y repetir igual con
la siguiente fila. Agregar 50 uL de la suspensión antigénica en cada pocillo.
• Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa.
• Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana.
• Realizar la lectura después de una hora y a las 24 horas
FUENTE: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Lectura
FUENTE: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Lectura
• La falta de reactividad (negativo), se
manifiesta por la sedimentación del antígeno
en forma de botón.
• La reactividad del suero (positivo), se
manifiesta por la formación de una malla de
bordes irregulares que cubre al 50-100% del
fondo del pocillo.
• Se considera positiva la muestra a partir de la
dilución ¼ y se informa con el título de la
última dilución positiva.
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)
• FUNDAMENTO
La técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), emplea
como antígeno epimastigotes de Trypanosoma, obtenidos
de cultivo y fijados en láminas sobre las que se realiza la
reacción antígeno-anticuerpo. La formación de este
complejo es evidenciada por una antiglobulina humana
marcada con fluoresceína (Figura 30). Los kits comerciales
proporcionan la lámina preparada y los reactivos. Prueba
altamente sensible y específica.
Se divide en dos
etapas:
• 1. El anticuerpo
primario no
marcado, se une
con el antígeno
diana.
• 2. El anticuerpo
secundario, lleva
el fluoróforo,
identifica al
anticuerpo
primario y se une
a él.
FUENTE: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Equipos
• Microscopio para fluorescencia.
• Estufa graduada a 37 °C.
• Balanza de precisión.
• Potenciómetro.
• Reloj.
• Refrigerador.
• Secadora o ventilador.
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Materiales y Reactivos
Placas para microtitulación, fondo en U.
• Couplin o recipientes para lavado de láminas.
• Puntas de 10-100 µL y de 0,5-10 µL.
• Pizetas.
• Papel, toalla o secante.
• Laminillas cubreobjetos de 24 x 48 mm.
• Cámara MPR - INS – 002.
• Solución de azul de Evans.
• Suero control positivo a Trypanosoma cruzi.
• Suero control negativo a Trypanosoma cruzi.
• Láminas IFI impregnadas con Trypanosomas.
• Conjugado Anti lgG humana.
• Buffer fosfato salino pH 7,4 .
• Glicerina tamponada pH 8,5.
Procedimiento
Procedimiento
• Se elaborar el protocolo de trabajo
Procedimiento
a) Retirar del congelador las láminas IFI fijadas con Trypanosomas y dejarlas
secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o
secador.
b) En una placa para microtitulación, realizar la dilución 1/32 de cada suero
y de los controles. Para ello, dispensar en cada pozo 155 µL de buffer
diluyente y 5 µL de cada suero por evaluar.
c) Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la
micropipeta varias veces, luego siguiendo el protocolo elaborado, dispensar
15 uL de la dilución 1/32 de cada suero sobre el área del círculo
correspondiente en la lámina IFI.
d) Colocar la lámina en una cámara húmeda y llevarla a incubar a la estufa
37 °C durante 30 minutos.
e) Retirar la lámina de la estufa y lavarla por tres veces consecutivas con
PBS-Tween 80 al 1% de la siguiente manera: la primera vez con la
ayuda de una pizeta retirar los sueros de la lámina, la segunda y tercera
vez en un frasco Coplin mantenido en agitación suave durante ocho
minutos cada vez.
• f) Colocar la lámina sobre papel secante y dejar secar a temperatura
• ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador.66 INSTITUTO NACIONAL
DE SALUD
• MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE
LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
• MPR - INS - 002
• g) Agregar 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluoresceína
• (titulado), en cada área circular e incubar a 37 °C por 30 minutos.
• h) Retirar la lámina de la estufa y lavar al igual que en el ítem e, después
• del último lavado, enjuagar con agua destilada y dejar secar al igual
• que en el ítem f.
• i) Agregar 15 uL de la solución diluida de azul de Evans en cada pocillo y
• dejar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
• j) Enjuagar la lámina con agua destilada, empleando una pizeta. Luego,
• dejarla secar a temperatura ambiente.
• k) Colocar una gotita de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla
• cubreobjetos
• l) Conservar la lámina en oscuridad hasta la lectura, se recomienda que
• sea el mismo día del procesamiento para evitar la pérdida de fluorescencia.
Lectura
- La lectura se realiza en microscopio para fluorescencia, con objetivo de
20X.
Primero revisar los controles, en el control positivo debe observarse la
superficie y el flagelo de los parásitos de un color verde manzana fluorescente.
y en el control negativo al igual que en el blanco de
reactivos, debe observarse el parásito de color opaco, sin fluorescencia.
- De acuerdo con la intensidad o ausencia de fluorescencia que muestran
los trypanosomas se registran las lecturas como:
• REACTIVO (+). Cuando la superficie o los bordes de los parásitos fluorescen
francamente de un color verde manzana.
• NO REACTIVO (-). Si los parásitos se observan opacos entre rojizos y marrones
oscuros
• INDETERMINADO (I), se observa una débil fluorescencia no homogénea en
Los parásitos.
Interpretación de los resultados
Fuente:
Conclusiones
• En el Perú existen 19 especies de vectores de la enfermedad de Chagas, con tendencia
de algunas especies silvestres a domiciliarse; el reservorio más importante en el sur es
el cobayo, en el norte roedores sinantrópicos y en la amazonia, mamíferos silvestres.
• La seroprevalencia indica que la enfermedad de Chagas aún es importante en el sur del
Perú, sin embargo, existen otras zonas de la región norte y nororiental con tasas de
infección entre 5 y 11%. La seroprevalencia en los bancos de sangre en zonas no
endémicas puede llegar hasta 2%, lo que revela la importancia del tamizaje
transfusional.
• La prueba de HAI tiene la ventaja que se procesa con rapidez y sencillez operativa y
también es adecuada para procesamiento de elevado número de muestras.
• Respecto a la IFI, sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere
experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el
equipamiento requerido no está al alcance de pequeños laboratorios y no es una
técnica adecuada para procesar elevado número de muestras.
• El tratamiento de los casos es gratuito y las pruebas de diagnóstico de laboratorio están
disponibles de acuerdo con el nivel de complejidad de los establecimientos de salud.
• EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS, DE
ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE Y LA
FORMACION PROFESIONAL.
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Encierran formas protozoáricas herpetomónicas. ¿Existe entre nosotros la tripanosomiasis
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Muchas gracias
