Electroforesis

Purificación de Proteínas
 Electroforesis
Es una de las técnicas más poderosas
para la purificación de moléculas
biológicas.
Definición
  Electroforesis: transporte de partículas
cargadas a través de un campo eléctrico. Basada
en la migración diferencial de las partículas
cargadas
Se puede utilizar tanto en escala:
• Analítica ( más conocida)
• Preparativa
 
Aspectos que afectas la separación:
• Carga de la proteína
• Tamaño de la proteína
• Forma de la proteína
Fundamentos
Inicialmente se desarrollaba electroforesis en medio líquido, pero se producía dispersión, se requirió de medios
que proporcionarán mayor resistencia mecánica, tales como:
• Celulosa
• Almidón
• Agar
• Poliacrilamida
Dichos medios resultan ser:
Más porosos
Altamente hidratados
        Disminuyen los efectos de calor generado

Todo el sistema sumido en un electrolito que sirve como buffer.

La partícula al estar cargada genera capas
de iones que la rodean.
 ECUACIONES

 
Cada componente se mueve a diferente velocidad, entonces se
logra separar la mezcla. Dicha velocidad de movilidad, velocidad
de la partícula (v) por unidad de campo eléctrico (E), se puede
expresar como:

 
Movilidad = v/E = k (pH-pI)/ mw
 
¿ Qué pasa a pH = pI ?
¿ Qué proteínas se demoran más en migrar, las grandes o las
pequeñas?
¿ Qué pasa se aplico un campo eléctrico muy grande?
 
USOS A NIVEL ANALÍTICO

 
Electroforesis se puede utilizar para determinar:
• Peso molecular de proteínas por medio de:
• Geles nativos (PAGE)
• Geles denaturantes (SDS-PAGE)

• Punto isoléctrico por geles de isoelectroenfoque

• Curvas de titulación por geles de isoelectroenfoque en dos

dimensiones
• Peso molecular y pI por geles en 2D.

• Actividad de enzimas por zimogramas

 SDS-PAGE

Separación por masa molecular, mw.

KDa KDa
 Isoelectroenfoque

Separación por pI
 Protein fractionation in multi-well device using Off-gel
isoelectric focusing
P. Michel, F. Reymond, DiagnoSwiss SA, Monthey/CH;I. Arnaud, J. Josserand, H.
Girault, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne/CH; J.S. Rossier, DiagnoSwiss SA,
Monthey/CH

Fraccionamiento inicial por pI

 Geles 2D
Separación por pI y mw
 Geles 2D automáticos

Laboratory system based on a plastic chip for 2D

A. Griebel, S. Rund, W. Dörner, R. Konrad, Institut für
Mikrotechnik Mainz GmbH/D

Tamaño de una tarjeta de

crédito
 Sistema Horizontal Sistema Vertical

Equipos
tradicionales de
electroforesis
analítica
 Usos a nivel preparativo

La metodología de geles en un soporte sólido pueden llegar a ser

tediosos, dado que se debe cortar el gel y luego eluir la
proteína, motivo por el cual se han desarrollado otras
metodologías como son:

-   Trabajar en medio líquido de películas muy delgadas o mediante

membranas.

• Las tecnologías más utilizadas son:

        Equipos de flujo libre

• Equipos de flujo libre más recirculación

 Equipos de flujo libre
 
No hay recirculación del medio
Distancias pequeñas de migración o estabilización rotacional

Equipos

        Películas Delgadas

Corriente continua y puntual de muestra sobre el buffer que se

mueve en forma vertical entre 2 capas. En la parte lateral están
los electrodos, hay un enfriamiento por refrigerantes

Uso para la separación de:

• Células
• Virus
• Partículas sub-celulares
• Componentes de membrana
Esquema de un equipo de
electroforesis de flujo
continuo en una celda de
electroforesis
Electroforesis anular

Cilindro externo gira hasta 150 rpm (lento) para neutralizar los
efectos convectivos radiales.
Equipos de flujo libre con recirculación
 
Celdas tipo tambor

Presenta compartimientos separados por discos de membranas

de poliéster con poros de 10 m, opera con gradiente de pH, la
descarga es por vacío.
 
Película delgada con recirculación

Se realizan ciclos de la muestra que ingresa en diferentes

canales como un isoelectroenfoque.
 Procesos Integrados

- Cromatografía de Lecho
expandido
-Cromatografía Anular Plana
 Cromatografía de Lechos Expandidos

El proceso consiste esencialmente de 6 etapas

a) Se tiene el lecho almacenado
b) Se estabiliza el lecho expandido a un determinado
nivel
c) Se equilibrio el lecho con buffer
d) Se carga el caldo directo de la fermentación
e) Se lava el lecho
f) Eluye y regenera el lecho
Cromatografía de Lechos Expandidos
Etapas de Etapas de carga del caldo
estabilización y
equilibrio
 Condiciones

• Se debe purificar un producto extracelular.

• El caldo se inyecta directamente a la columna,

se ahorran las etapas de:
• Separación de células
• Concentración
• Purificación
 Cromatografías Continuas: Cromatografía Anular

Idea:
Inyectar continuamente la muestra
 Condiciones

• Inyectar continuamente la muestra, reemplaza a

los carruseles de columnas.
Cromatografía de Afinidad en membrana

Etapa 1 se carga la membrana

Membrana de
afinidad

Efluente Libre de células y productos de

interés
Cromatografía de Afinidad en membrana

Etapa 2 se eluye la proteína

adsorbida
Buffer de elución
Membrana de
afinidad

Eluye sólo la proteína

de interes que estaba
adsorbida en la
membrana
Detalles de un sistema integrado

Detalles de la membrana


R e te n ta te
h M e m b ra n e
F iltr a te

Feed R
 Feed

F ilt r a t e
M e m b ra n e
R e te n ta te
 Resultados de la Integración
• Evaluación de los niveles de recuperación
Muestra desde
el Bioreactor

0.09 0.09

Abs (280 nm)

Abs (280 nm)

0.08
0.07
0.06
0.05 0.04
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00 -0.01
-0.01
0 10 20 30 0 10 20 30
Elution time (min) Elution time (min)

Elución ciclo 2
Elución ciclo 3

Castilho LR, Anspach FB, Deckwer WD (2002), An integrated process for mammalian cell perfusion
cultivation and product purification using a dynamic filter. Biotechnol. Prog., 18, 776-781.
 Condiciones

• Se debe purificar un producto extracelular.

• El caldo se inyecta directamente a la columna,

se ahorran las etapas de:
• Separación de células
• Concentración
• Purificación

• Se puede trabajar a flujos altos pues la

membrana es resistente
 Electrofiltración
Filtración a la que se le aplica un campo eléctrico, 
La torta se minimiza y el proceso es más rápido

Tradicional Electrofiltración
 Tecnología de purificación magnética
para proteínas inmovilizadas

La idea consiste en inmovilizar la proteína a partículas

que tengan propiedades magnética.
Posteriormente, las partículas magnéticas son atrapadas
en un campo eléctrico, quedando solo ellas retenidas y el
resto de las especies de la mezcla son eliminadas.

Por ultimo, se desorben las proteínas desde las partículas

magnéticas.
Diagrama general
Nuevos Materiales Cromatográficos
Monolith Separation Technology
http://www.monoliths.com/

Soporte Monolith:
Materiales son una sola
pieza, altamente
interconectada con
grandes y pequeños
canales.
Ventajas
• Tiempos cortos de separación
• Sitios activos fácilmente accesibles
• Altas capacidades para moléculas grande
• Varios tipo de cromatografía: Intercambio Iónico,
Filtración por geles
• Columnas, Discos
 USOS
Filtración por Geles
• Normalmente se trabajan a flujos < 1.0 ml/min

• Nuevos materiales Flujos = 5 ml/min