Asociacin
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela Profesional de Medicina Humana
Seminario
:ESPECTROFOTOMETRA
Curso
:Bioqumica y Nutricin
Alumnos
: RAMOS VEGA, Lisbeth
VALVERDE GARCIA, Paolo
Ciclo
: III
Sede
: CHORRILLOS
Turno
: TB
ESPECTROFOTOMETRIA
ESPECTROFOTOMETRIA
Es el mtodo de anlisis ptico ms usado
en las investigaciones qumicas y
bioqumicas.
Espectro
Foto
Metr
a
Espectro de radiacin
electromagntica
Luz visible
Medicin
ESPECTROFOTOMETRIA
Es el conjunto de tcnicas que utilizan la
luz para medir la concentracin de las
sustancias qumicas.
En la bioqumica se utiliza para:
Conocer la concentracin de un compuesto
en una disolucin.
Determinar la glucosa en la sangre en un
laboratorio de anlisis qumico.
-
EL ESPECTROFOTMETRO
Es un instrumento
que
permite
comparar la radiacin
absorbida
o
transmitida por una
solucin que contiene
una
cantidad
desconocida
de
soluto, y una que
contiene
una
cantidad conocida de
la misma sustancia.
EL ESPECTROFOTMETRO
CONCEPTOS QUIMICOS
Soluciones Molares
Son aquellas que en 1 litro de agua hay disuelto el
peso molecular de la sustancia expresada en
gramos. Ejemplo: Una solucin (M) molar de
cloruro de sodio (peso molecular=58,5) tiene 58,5
gr disueltos en 1 litro de agua
Soluciones Normales
Son aquellas que en 1 litro de agua hay disuelto el
peso molecular de la sustancia expresada en
gramos dividido por el nmero de electrones que
intercambia en la reaccin que se va a utilizar.
CONCEPTOS QUIMICOS
Porcentaje de masa / volumen ( m /v)
% soluto (p/v) = gramos de soluto x 100
ml de disolucin
Ejemplo:
Se ha pesado 2,25 g de NaCl y se disuelve con
250 mL de agua destilada. Determinar el % de
soluto y de acuerdo al resultado mencionar si se
trata de un suero fisiolgico:
Desarrollo
% soluto (p/v) = 2,25 g x 100 = 0,9 %
250 mL
Se trata de un suero fisiolgica ya que se
encuentra a la concentracin del 0,9%
CONCEPTOS FISICOS
La absorcin de las radiaciones ultravioleta,
visibles e infrarrojas depende de la estructura de
las molculas, y es caracterstica para cada
sustancia qumica.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la
energa es absorbida; la energa radiante no
puede producir ningn efecto sin ser absorbida.
INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA
FENMENO DE ABSORCIN
Este concepto se relaciona mas con la muestra
puesto que nos indica la cantidad de luz
absorbida por la misma, y se define como el
logaritmo de 1/ T, en consecuencia :
A = log 1/T = -log T = -log I t / I o.
INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA
FENMENO DE EMISIN
Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al
estado fundamental produciendo la emisin de energa
radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y,
en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la
fluorescencia.
Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de
absorcin caracterstico
Absorbancia
Las longitudes de onda con mayor absorcin (picos) correspondern de
forma general a aquellas con las que se leer la muestra para
determinar su concentracin
Absorbancia
La relacin entre la absorbancia por una sustancia a una l determinada
y su concentracin es directamente proporcional es decir: a mayor
concentracin mayor proporcin de luz absorbida.
FRECUENCIA (F)
La frecuencia tiene relacin inversa con la
longitud de onda, a mayor frecuencia menor
longitud de onda.
La unidad de medida de la frecuencia es el
hertz (Hz).
Frmula:
(velocidad = V = 300,000Km/s)
Imagen:
[Link]
if
ESPECTRO DE LUZ
La radiacin de la luz visible es la que nos permite ver los
objetos del mundo material que nos rodea.
Se
localiza aproximadamente entre 3,8 x 1014 Hz (380 THz)
correspondiente a la frecuencia del color violeta y los 7,5 x 10 14
Hz (750 THz) perteneciente a la frecuencia del color rojo.
El
sol es la principal fuente de la luz visible natural que
poseemos.
Color
Longitud de
onda
violeta
380450 nm
azul
450495 nm
verde
495570 nm
amarillo
570590 nm
naranja
590620 nm
rojo
620750 nm
Imgenes de:
[Link]
longitud de onda
luz que se
Aproximada
refleja o ve
380 450 nm
verdoso
450 495 nm
495 570 nm
570 590 nm
590 620 nm
Azul verdoso
620 750 nm
Verde azulado
color de luz que se
color de
absorbe
Violeta
Azul
Verde
Amarillo
Naranja
Rojo
Amarillo
Amarillo
Rojo
Azul
ESPECTRO ELECTROMAGNTICO
Es el conjunto de ondas electromagnticas que se encuentran
ordenados de acuerdo a su longitud de onda () y frecuencias
(F), as tenemos:
Rayos X (1-100 nm)
Ultravioleta (100-380 nm)
Visible (380-750 nm)
Infrarrojo (750-100 000 nm)
Microondas (100 000- 1 000 000 nm)
TRANSMITANCIA
Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio,
se registra una cierta prdida de intensidad,
debido a la absorcin por parte de la sustancia.
Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin
entre la intensidad de luz transmitida por una
muestra problema (I) con la intensidad de luz
incidente sobre la muestra (Io):
T = I / I0 (Se expresa como % T)
La representacin grfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente
de concentraciones y se denomina CURVA DE
CALIBRACION
Concen
tracin
LEY DE BEER
Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente
a medida que la concentracin del medio absorbente aumenta
I0
I = I0e-ac
I0
I0
LEY DE BEER
La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que
conociendo la absorbancia de una sustancia
podemos averiguar su concentracin y esto lo
podemos hacer de dos formas:
1. Por comparacin con una solucin conocida: si
tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una
estndar (S), podemos establecer una relacin
matemtica entre ellas.
2. A travs de una curva de calibracin
LEY DE LAMBERT
Cuando un rayo de luz monocromtica (I0) pasa a travs de un
medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente
(I) a medida que la longitud del medio absorbente aumenta
I = I0e-ab
I0
1 cm.
I0
2 cm.
I0
3 cm.
LEYES DE BEER - LAMBERT
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley
de Beer-Lambert donde la fraccin de luz incidente que es
absorbida por una solucin es proporcional a la
concentracin de soluto y al espesor de la sustancia
atravesada por la luz. La relacin entre la luz incidente (I0) y
la trasmitida (I) dar una idea de la cantidad de radiacin que
ha sido absorbida por la muestra.
FORMAS DE EXPRESAR LA CONCENTRACION
UNIDAD
EXPRESION
DESCRIPCION
Describe la cantidad en
%p/p
% Soluto = gramos de Soluto x 100
gramos de Soluto o de
Porcentaje
gramos de solucin
peso a
solvente presentes en 100
peso
% Solvente = gramos de solvente x100
gramos de solucin.
gramos de solucin
%p/v
Es una forma de expresar
Porcentaje
los gramos de Soluto que
Peso a
% Soluto = gramos de Soluto x 100
volumen
mililitros de solucin
existen en un volumen de
100 mL de solucin.
%v/v
Porcentaje % Vol. de Soluto = mililitros de Soluto
volumen a 100
mililitros de solucin
volumen
Se emplea para expresar
x concentraciones
lquidos
expresa
de
el
volumen de un Soluto en
un volumen de 100 mL de
solucin.
UNIDADES QUIMICAS DE CONCENTRACION
UNIDAD
EXPRESION
Molaridad
(M)
M= # Moles de Soluto
Litro de solucin
DESCRIPCION
Corresponde al nmero de moles
de Soluto por cada litro de
solucin.
Expresa
Normalidad N = # de equivalentes-gramo de Soluto
Litro de Solucin
(N)
el
nmero
equivalentes-gramo
de
de
Soluto
por cada litro de solucin.
Se denomina fraccin molar al
Fraccin
Molar (X)
XA=
nA
Fraccin de Soluto
nA + nB
cociente entre el nmero de
moles de un componente de una
mezcla (A=soluto y B=solvente) y
el nmero total de moles de
XB =
n B Fraccin de Solvente
nA + nB
todos los componentes.
Est definida como el nmero de
Molalidad (m) M = # de moles Soluto
Kg de Solvente
moles de Soluto por Kilogramos
de solvente.
Cuantificacin de
Protenas
Determinar
la concentracin de
protenas en una muestra biolgica
es una tcnica de rutina bsica
cuando se aborda un esquema de
purificacin de una protena concreta,
cuando se quiere conocer la actividad
especfica
de
una
preparacin
enzimtica, para el diagnstico de
enfermedades, as como para otros
muchos propsitos.
MANEJO DE ESPECTROFOTMETRO
Prender el aparato (a)10 minutos antes de utilizarse, se activar la
luz roja de encendido (b).
Seleccionar la longitud de onda con el botn (c).
Ajuste (con a) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y sin
muestra.
Insertar la cubeta con el blanco en su seccin (d).
b
d
c
a
Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)
Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra problema, e
insertar en su espacio, bajar la tapa.
La aguja (d) del lector se deslizar sobre la escala (f) , se lee en %
de transmitancia en unidades de absorbancia
f
d
COMPONENTES
> Una fuente estable de energa radiante
> Un sistema de lentes, espejos y aberturas (Slits ), que definan
y enfoquen el haz de radiacin y un monocromador que separe la
radiacin de bandas estrechas de longitud de onda.
> Un componente transparente a la radiacin que contenga la
muestra (cubeta)
> Un detector de radiacin o transductor que recibe la seal de
radiacin electromagntica y la convierte en una seal elctrica
de magnitud proporcional a la intensidad de la radiacin recibida.
> Un sistema amplificador que produzca o genere una seal
elctrica mucho mayor a la seal recibida
> Un sistema de lectura tal como: Una escala de aguja, un
registrador, un sistema de dgitos o una computadora, que
transforme la seal elctrica en una seal que el operador pueda
interpretar.
Espectrofotmetro de barrido para el espectro visible Biochrom Libra S6
Espectrofotmetro de barrido para el espectro visible fcil de utilizar, resulta ideal
para el CC y para su empleo rutinario en laboratorios industriales, de
biotecnologa y de enseanza.
- Mide la absorbancia, el porcentaje de transmisin, el ratio de absorbancia,
concentracin y cintica en la longitud de onda 330 nm - 800 nm
- Puede almacenar hasta 99 mtodos y posee una pantalla grfica de gran
tamao con iluminacin posterior
- Se conecta en un PC o en un registrador grfico
- Se puede limpiar y descontaminar con facilidad
- Incluye el software Grafico PC para exportar los resultados a Excel.
Impresora en serie y cable de impresora en serie.
Adaptadores de probeta (10, 12, 16 mm).
Cable de interface de registrador grfico.
CUIDADOS
Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con
precipitados.
El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar
que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un pao
limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla.
La cubeta se sujeta por los lados opacos.
La cantidad a adicionar es, mximo, hasta partes de la cubeta
No se deben derramar lquidos, sobre todo solventes, cidos o lcalis;
dentro del contenedor de la cubeta, se puede daar parte del mecanismo
Se debe mantener, el espectrofotmetro, limpio y libre de humedad
GRACIAS
