DOCENTE:
HECTOR VILCHEZ CCEDA
ESTUDIANTES:
MALLQUI HUERTA, MILAGROS
MARTNEZ PARADO, WILLY
PRUEBA DE WESTERN BLOT
INTRODUCCIN
El Western Blot, o Inmunoblot,
es una tcnica analtica usada
para detectar protenas
especficas en una muestra
determinada. Mediante una
electroforesis en gel se separan
las protenas.
Las protenas son transferidas
desde el gel a la membrana
electroforticamente.
Es una tcnica analtica
usada para detectar
protenas especficas en
una muestra
determinada (una
mezcla compleja de
protenas, como un
extracto tisular).
PRUEBA DE WESTERN BLOT
DEFINICIN
PRUEBA DE WESTERN BLOT
FUNDAMENTO
La tcnica de inmunotransferencia (immunoblotting o
Western Blot) es un sistema rpido y muy sensible para
la deteccin y caracterizacin de protenas que se basa
en la especificidad de reconocimiento entre antgeno y
anticuerpo. Implica la separacin por electroforesis en
geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa
e irreversible a una membrana, de las protenas de una
mezcla compleja (lisado total celular). Los antgenos
que se han transferido a la membrana son reconocidos
por anticuerpos monoclonales policlonales especficos
de ellos.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
FUNDAMENTO
Las protenas suelen tener carga neta; por lo tanto, si
se aplica un campo elctrico a una solucin que
contenga una mezcla de protenas, stas migrarn a
una velocidad que depender de su carga neta, forma
y peso molecular. Esta tcnica es conocida como
electroforesis.
Las separaciones electroforticas se realizan casi
siempre en soportes slidos, generalmente para
separar una mezcla de protenas, el soporte de
eleccin son los geles de poliacrilamida.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
FUNDAMENTO
PRUEBA DE WESTERN BLOT
TIPOS
1.- Directo:
El anticuerpo primario marcado
se une al antgeno de la
membrana y reacciona con el
sustrato originando una seal
detectable. En el mtodo
directo de deteccin, el
anticuerpo primario que se
utiliza para detectar el antgeno
sobre la superficie de la
membrana, debe ir marcado
con una enzima
PRUEBA DE WESTERN BLOT
TIPOS
2.- Indirecto:
El anticuerpo primario sin marcar
reacciona con el antgeno. Luego,
un anticuerpo secundario marcado
se une al primario y reacciona con
el sustrato. En el mtodo
indirecto, se aade primero un
anticuerpo primario sin marcar
contra el antgeno de la superficie
de la membrana; posteriormente
se aade un anticuerpo secundario
marcado contra el anticuerpo
primario.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
PROCEDIMIENTO
PREPARACION DE LA MUESTRA
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin.
Despus se procede a homogenizarlos:
Licuadora (para grandes volmenes de muestra),
Homogenizador (para muestras pequeas).
Por ltimo se centrifuga para obtener
las protenas en el sobrenadante, la
fraccin no precipitada. Las clulas
pueden lisarse por uno de esos
mtodos mecnicos. Tambin pueden
usarse detergentes, sales o tampones
que favorezcan la lisis y solubilicen las
protenas.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
PROCEDIMIENTO
Equipo:
Tubos Eppendorf
Centrfuga
Vrtex
Buffer Tritn X 100:20 mM
Tris HCl pH 8; 137 mM
NaCl; 10% glicerol; 1%
Tritn X 100; 2 mM EDTA.
EQUIPAMIENTO:
Fuente de poder
Cuba para electroforesis vertical
Cuba para transferencia
Bloques de hielo
Sistema de armado de sandwichs para
transferencia
Membranas de nitrocelulosa
Papeles absorbentes (tipo Whattmann)
Cables de conexin
Matraces capaces de contener los volmenes
de las soluciones
Balanza analtica
Probetas capaces de medir los volmenes
requeridos
Micropipetas automticas
Puntas (tips) azules y amarillas.
REACTIVO:
WESTERN BLOT
PRUEBA DE WESTERN BLOT
PROCEDIMIENTO
1- Inmovilizacin de protenas sobre la membrana, generalmente
mediante electrotransferencia.
CONSTA DE CINCO ETAPAS:
Se construye lo que se conoce
como sndwich, donde se
apilan sucesivamente una
esponja plana, papel
absorbente, el gel, la
membrana sinttica, ms
papel y finalmente otra
esponja plana.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
PROCEDIMIENTO
2- Saturacin de todos los lugares de unin de protenas de la
membrana no ocupados para evitar la unin no especfica de
anticuerpos.
Bloqueo de la membrana, para prevenir la unin
inespecfica de los anticuerpos a otras protenas la membrana,
con el riesgo asociado de tener un elevado background o
falsos positivos.
3- Incubacin del Blot con anticuerpos primarios contra la/s
protena/s de inters.
La eleccin del anticuerpo primario para un Western Blot depender del
antgeno que se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese
antgeno.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
PROCEDIMIENTO
4- Incubacin del Blot con anticuerpos secundarios, o reactivos
que actan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas
u otros marcadores.
Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que
reconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario).
5-Sistema de revelado
de las bandas de
protenas marcadas
con el complejo de
anticuerpos.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
APLICACIONES: Diagnsticos
Prueba de VIH
Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el
Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA
da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una
poblacin donde la prevalencia del virus es muy baja.
Mediante el Western Blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en
una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana
las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
APLICACIONES
Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata
espongiforme bovina, comnmente llamada "enfermedad de las
vacas locas".
Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el
Western Blot.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
APLICACIONES: Investigacin
El Western Blot es una de las tcnicas ms usadas en
el estudio de Biologa molecular.
Con ella se pueden determinar los niveles de una
protena antes y despus de un tratamiento, su nivel
de fosforilacin u otras modificaciones
post traduccionales, etc.
PRUEBA DE WESTERN BLOT
CASO CLNICO
http://www.youtube.com/watch?v=Mn6DivNY
u8U
